煙草赤星病菌拮抗菌的篩選鑒定及發酵液穩定性分析*

張艷軍， 郭 榮

(浙江師范大學 化學與生命科學學院,浙江 金華 321004)

煙草赤星病是在煙草成熟期發生的一種真菌性葉斑類病害[1]，不但會影響烤煙產量、產值，還會影響煙葉的評吸質量[2].在我國，煙草赤星病在煙草產區發生較普遍，一般煙田發病率為5%～10%，重病田達10%～20%，嚴重發病田甚至可達50%以上，是煙草生產上威脅最大的病害之一[3].目前煙草生產中化學防治是防治煙草赤星病的重要措施，缺點是容易引起病原菌產生耐藥性、造成農藥殘留和污染環境[4].隨著對煙草及煙草制品安全性要求的提高，減少化學農藥使用、生產綠色產品已經成為農業生產中新的發展方向.因此,生物防治越來越引起煙草界的關注.

篩選煙草赤星病菌拮抗菌是實施生物防治的一項重要工作，也是國內外科研工作者研究的熱點，對于解決煙草生產中農藥殘留及環境保護方面都具有重要意義.研究以煙草赤星病菌為指示菌，通過瓊脂塊法和管碟法從土壤中篩選對煙草赤星病菌抑菌效果明顯的拮抗菌株，進而對其進行分類鑒定和抗菌譜測定，同時對拮抗菌發酵液中抗菌活性物質穩定性進行研究，期望為后續分離純化實驗提供參考依據.

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株來源

煙草赤星病菌(Alternariaalternata)、楊樹潰瘍病菌(Dothiorelagregaria)、番茄早疫病菌(Alternariasolani)、小麥赤霉病菌(Gibberellazeae)、黃瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporium)、水稻白葉枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae)均由安徽農業大學生命科學學院張應烙老師惠贈.

1.1.2 培養基

PDA(馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基)和PD液體培養基組成見文獻[5].鑒定培養基為固體淀粉培養基、糖發酵試驗培養基、葡萄糖蛋白胨水培養基、蛋白胨水培養基、Simons氏檸檬酸鹽培養基、明膠培養基等[6].

1.2 方 法

1.2.1 煙草赤星病菌拮抗菌株的篩選

首先采用稀釋涂布平板法[6]對采集土樣中放線菌株進行分離純化，將獲得的菌株接種至試管斜面，并在4 ℃條件下保藏.采用瓊脂塊法[7]對分離得到的放線菌進行初篩，獲得對煙草赤星病菌具有抑菌活性的拮抗菌株.最后采用管碟法[8]對初篩獲得的拮抗菌株進行復篩，獲得對煙草赤星病菌拮抗能力最強的放線菌菌株ZJNU968，用于后續實驗.

1.2.2 煙草赤星病菌拮抗菌株的分類鑒定

菌株形態觀察和生理生化測定參照文獻[6]，同時對其16S rDNA序列進行測定，并運用軟件MEGA 5.05按照Neighbour-Joining 法構建系統發育樹，確定未知菌種的分類地位.

1.2.3 煙草赤星病菌拮抗菌株抗菌譜測定

煙草赤星病菌為真菌性植物病原菌，因此，利用管碟法考察了拮抗菌發酵液對其他真菌性病原菌，如楊樹潰瘍病菌、番茄早疫病菌、小麥赤霉病菌和黃瓜枯萎病菌的抑菌效果.為了考察拮抗菌是否能拮抗非真菌性植物病原菌，利用管碟法考察了拮抗菌發酵液對細菌性病原菌水稻白葉枯病菌的抑菌效果.

1.2.4 拮抗菌株發酵液抑菌穩定性測定

將斜面保藏的拮抗菌株接種至PDA平板，并置于28 ℃培養箱.5 d后用打孔器取直徑6 mm的菌塊至1.5 mL離心管，加入1 mL無菌水，洗下菌體和孢子，一并接入到250 mL搖瓶(含有30 mL PD液體培養基).將該搖瓶置于180 r/min,28 ℃的搖床中培養5 d，然后將發酵液轉移至80 mL離心管中，并在10 000 r/min條件下離心15 min.所得上清液用于發酵液穩定性實驗，其處理方法參見文獻[5]，并采用管碟法檢測抗菌活性，同時以原始無菌發酵濾液作為對照.

2 結果與分析

2.1 煙草赤星病菌拮抗菌株的篩選

從浙江省金華市婺城區采集的16份土樣中篩選得到224株放線菌，以煙草赤星病菌為指示菌，采用瓊脂塊法篩選出6株具有拮抗作用的放線菌，其抑菌圈直徑為1.20～2.90 cm.在此基礎上，采用管碟法對初篩得到的6株拮抗菌株進行復篩，其中以菌株ZJNU968的抑菌效果最好，抑菌圈直徑達到3.60 cm.因此，將該菌株用于后續試驗.

2.2 拮抗菌ZJNU968分類鑒定

2.2.1 菌株形態特征

菌株ZJNU968在PDA培養基上菌落較小、圓形、微隆起、干燥、邊緣整齊且不透明.菌落正面初期為白色，5 d后呈現灰色，菌落背面呈微黃色.該菌株氣生菌絲和基內菌絲均很豐富，且有大量分枝，孢子絲呈螺旋狀，孢子呈短圓柱形.

2.2.2 菌株生理生化特性

菌株ZJNU968淀粉水解現象明顯，可以使明膠液化，能利用葡萄糖、乳糖生長.該菌株糖發酵試驗(葡萄糖和乳糖)、甲基紅試驗、伏普試驗、吲哚試驗均為陰性，檸檬酸鹽試驗為陽性.

2.2.3 分子生物學鑒定

菌株ZJNU968的16S rDNA基因序列(1 443 bp)己提交至GenBank網站(基因庫登錄號為JX235956).從GenBank,EzTaxon等數據庫調集鏈霉菌屬相關菌株16S rDNA序列，并以青孢鏈霉菌(Streptomycesglaucosporus)為外群,按照N-J法構建系統發育樹，如圖1所示.菌株ZJNU968與StreptomyceslunalinharesiiRCQ1071[9]處于同一進化分支，二者序列相似性達98%，而且二者形態特征和生理生化特征基本一致.因此,確定菌株ZJNU968為Streptomyceslunalinharesii.

圖1 系統發育樹狀關系圖

2.3 拮抗菌ZJNU968抗菌譜測定

抗菌譜測定結果見表1.結果表明：StreptomyceslunalinharesiiZJNU968菌株發酵液對黃瓜枯萎病菌和水稻白葉枯病菌抑菌圈直徑分別為2.95 cm和3.41 cm，同時對其他3種供試病原菌也有較強的抑制性.因此,ZJNU968菌株發酵液中含有的抗菌活性物質具有較為廣譜的抗菌活性.

表1 ZJNU968菌株發酵液抗菌譜測定

2.4 拮抗菌株ZJNU968發酵液抑菌穩定性測定

2.4.1 熱穩定性

由圖2可知，拮抗菌發酵液中生物活性物質隨溫度升高而抑菌活性逐步下降.在30 ℃時，拮抗菌株ZJNU968發酵液對煙草赤星病菌的抑菌圈直徑達3.80 cm，與對照相當；在50 ℃時，該菌株發酵液保持良好的抑菌效果，抑菌圈直徑為3.10 cm；在90 ℃時，菌株ZJNU968發酵液抑菌活性顯著下降，抑菌圈直徑減至2.35 cm；在121 ℃時，發酵液抑菌活性全部喪失.因此,拮抗菌ZJNU968發酵液中抗菌活性物質具有較強的熱穩定性，但高溫會破壞其結構.

2.4.2 酸堿穩定性

拮抗菌株ZJNU968發酵液pH被分別調至2.77,3.48,4.34,5.26,6.12,7.16,8.28,9.22,10.30，其中5.26為原始發酵液的pH值.由圖3可知：在pH 2.77～4.34時，抑菌圈直徑略低于對照pH 5.26；在pH 5.26～7.16時，發酵液抑菌活性與原始發酵液相近；在pH 8.28下發酵液抑菌活性最強，隨著pH進一步增加，發酵液抑菌活性均呈逐步下降趨勢.因此,拮抗菌ZJNU968發酵液在pH 2.77～10.30時具有良好的穩定性.

*表示P< 0.05;**表示P<0.01

圖3 pH對ZJNU968菌株發酵液抑菌活性影響

2.4.3 光照穩定性

由圖4可知，在紫外光下照射1,2,4 h的ZJNU968菌株發酵液抑菌圈直徑與對照相當.因此,紫外光照射對發酵液抑菌活性無影響.由圖5可知，在自然光下照射3,6 h后的ZJNU968發酵液抑菌圈直徑與對照接近，自然光照射9 h的發酵液抑菌圈直徑略有下降，但仍有3.07 cm.因此,拮抗菌ZJNU968發酵液具有良好的光照穩定性.

3 討 論

煙草赤星病于1892 年首先在美國發現,多次給世界煙葉生產帶來較大的經濟損失[10].在1916年，人們首次在北京地區發現了煙草赤星病，隨后該病害在全國各地慢慢被報道.目前各地主要采用抗病育種、化學防治、生物防治、農業防治等方法防治煙草赤星病[11].目前,生物防治煙草赤星病是一種比較有效和發展潛力較大的防治方法，認為是目前最安全的防治措施，符合環境保護和有機食品發展要求[12].當前國內外學者對煙草赤星病菌拮抗菌的研究已經取得了一些成果.廉立慧等[13]采用對峙平板法從茄子根圍土壤中篩選得到一株對煙草赤星病菌有明顯拮抗作用的多產色鏈霉Q14，其抑菌帶寬為1.45 cm，并且該菌株對黃瓜枯萎病菌、番茄枯萎病菌也有較強的拮抗作用.馬志遠等[14]從煙草表面及根際土壤中分離得到1株對煙草赤星病有拮抗效果的解淀粉芽孢桿菌M-07C2F，其抑菌條帶寬度達1.42 cm.筆者利用瓊脂塊法和管碟法從土壤中篩選得到一株對煙草赤星病菌具有良好抑菌活性的菌株ZJNU968，同時該菌株具有較為廣譜的抗菌活性，對其他5種供試病原菌皆具有較強的抑制活性.根據該菌株的形態特征、生理生化特征和分子生物學鑒定的結果，確定該菌株為Streptomyceslunalinharesii.目前研究表明，Streptomyceslunalinharesii對香蕉枯萎病[15]、短小芽孢桿菌LF-4[16]具有一定的抑制作用，但本研究所發現的Streptomyceslunalinharesii對煙草赤星病菌的抑菌活性尚屬首次報道.

圖4 紫外光對ZJNU968菌株發酵液抑菌活性影響

*表示P< 0.05

近年來發展形成的生物與化學協同控制植物病害策略，既能有效地控制病害的發生，又能降低化學藥劑在農副產品中的殘留，這就要求所用的抗菌活性物質要具有良好的穩定性，才能在與化學藥劑混合使用中保持較高活性.本研究對ZJNU968菌株發酵液的抑菌穩定性研究結果表明：拮抗菌ZJNU968發酵液具有較強的熱穩定性，但90 ℃以上的高溫會對其活性造成嚴重影響；該拮抗菌發酵濾液在pH 2.77～10.30內具有良好的穩定性，同時也具有良好的光照穩定性.此外，拮抗菌ZJNU968所產生的抑菌活性物質對煙草赤星病菌的抑菌圈直徑達到了3.60 cm，優于多產色鏈霉菌Q14(1.45 cm)、芽孢桿菌M-07C2F(1.42 cm)和枯草芽孢桿菌L3(1.70 cm)[17]，有望將其開發成一種新型生物農藥，用于煙草赤星病的防治.目前本實驗室正在對菌株ZJNU968發酵液中抗菌活性物質進行分離純化和結構解析，后續還將進一步研究活性物質的抑菌機理和田間防治效果.