新發重型再生障礙性貧血患者外周血CD4+CD25+T細胞及其細胞因子表達觀察

鐘敏,蘇群豪，胡敏，徐璐，陶石

(海南醫學院第一附屬醫院,海口570102)

重型再生障礙性貧血(SAA)是一組因造血干細胞損傷導致的骨髓衰竭性疾病[1]。研究證實，SAA的免疫發病機制主要為細胞免疫功能持續異常、自身免疫耐受失調，導致造血干細胞凋亡[2]。CD4+CD25+調節性T細胞(Treg)被認為在SAA發病中起了極為重要作用[3]。由于Treg能顯著調節免疫，有效抑制自身免疫反應，維持機體免疫平衡，因此多種自身免疫疾病發病過程中均存在Treg數量或功能異常。臨床研究[4]證實，Treg參與SAA發病，然而Treg以及其他T淋巴細胞亞群與SAA患者的預后是否存在相關性仍未明確[5]。本研究觀察了初發SAA及緩解期SAA患者Treg細胞及CD4+T細胞、CD8+T細胞亞群百分比變化，并探討了Treg與患者預后的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年1月～2017年7月海南醫學院第一附屬醫院就診的SAA患者66例，均符合張之南等編纂的《血液病診斷及療效標準》[5]。男34例、女32例，年齡32～64(49.6±14.3)歲。納入標準:患者骨髓單個核細胞的Coomb′s試驗為陰性；臨床資料齊全，且按照醫囑隨訪。排除標準:合并有嚴重的心、肺、肝、腎等重要器官功能不全；罹患其他血液系統性疾病；近期6個月內使用皮質類固醇激素及免疫抑制劑者。66例SAA患者中，新發30例(新發組)，其中男18例、女12例，年齡(54.2±13.4)年,有糖尿病史6例、高血壓史8例；SAA經免疫抑制劑初治后恢復(恢復標準:血象恢復，網織紅細胞≥20×109/L，血小板≥20×109/L，ANC≥1.0×109/L；骨髓增生活躍，紅系及粒系的比例恢復正常，巨核細胞計數≥8個/HP；不需要輸血治療)的患者36例(緩解組)，其中男16例、女20例，年齡(48.3±14.2)歲，有糖尿病史12例、高血壓史16例。兩組年齡、性別、既往病史等有可比性。

1.2 外周血中Treg、CD4+T細胞、CD8+T細胞檢測 兩組均在納入研究后第2天清晨空腹取肘靜脈血3～5 mL，加入EDTA抗凝。采用FACS Canto Ⅱ型流式細胞儀(購自美國BD公司)分別檢測各組患者外周血中Treg及CD4+T細胞、CD8+T細胞百分比，并計算CD4+T/CD8+T、Treg/CD4+T。

1.3 血清Treg分泌的細胞因子IL-10、IL-35、TGF-β檢測 應用細胞分離液分離外周血單個核細胞，再依據免疫磁珠儀使用說明書進行Treg分選，將分選好的Treg以1×106/L濃度接種于24孔板，每組設3個復孔，每孔中加5 mg/mL濃度的植物血凝素予以5%的CO2環境下培養過夜后，收集各組上清液，均應用ELISA法檢測IL-10、IL-35以及TGF-β。

1.4 隨訪 兩組研究對象出院后均予以電話或門診隨訪，隨訪時間為4～12個月、中位隨訪時間10個月。隨訪期間記錄患者血象、Treg及CD4+T細胞、CD8+T細胞百分比、并發癥等主要指標，隨訪結局為死亡或急性復發。復發標準:骨髓細胞增生程度小于正常25%；血象具備三項中兩項，如網織紅細胞絕對數<20×109/L、血小板絕對數<20×109/L、中性粒細胞絕對值<0.5×109/L。

2 結果

2.1 兩組外周血Treg、CD4+T細胞、CD8+T細胞百分比比較及其之間的相關性 與新發組相比，緩解組Treg百分比、CD8+T細胞及Treg/CD4+T高，CD4+T細胞百分比及CD4+T/CD8+T均低(P均<0.05)，見表1。SAA患者Treg百分比與CD4+T細胞、CD4+T/CD8+T呈負相關(r=-0.689，P=0.035；r=-0.724，P=0.029)，與網織紅細胞百分比呈正相關(r=0.667，P=0.038)。

表1 兩組外周血CD4+T細胞、CD8+T細胞及Treg百分比

2.2 兩組血清IL-10、IL-35以及TGF-β水平比較 緩解組血清IL-10、IL-35及TGF-β水平高于新發組(P均<0.05)，見表2。

表2 兩組血清IL-10、IL-35以及TGF-β水平

組別nIL-10IL-35TGF-β新發組30157.9±22.259.4±7.965.5±9.6緩解組36181.3±29.565.3±8.772.6±8.4

2.3 SAA患者預后相關因素 66例SAA患者隨訪期間死亡22例、急性復發14例。以SAA患者預后為應變量，將外周血CD4+T細胞、CD8+T細胞、Treg、CD4+T/CD8+T、Treg/CD4+及血清IL-10、IL-35以及TGF-β水平為自變量，應用全模型多元Logistic回歸分析方法進行回歸分析，結果顯示Treg及Treg/CD4+T與SAA預后有關(P均<0.05)，見表3。

表3 SAA患者預后相關因素多元Logistic回歸分析結果

3 討論

盡管SAA具體的發病機制仍未完全明確，但是眾多臨床研究證實SAA是一種CD4+T細胞功能亢進的自身免疫疾病，T淋巴細胞各亞群數量、表型以及免疫功能的變化為該病主要發病機制[1，6]。CD4+T細胞數量增加，CD4+T、CD8+T細胞比例失衡引起免疫偏移，致使造血微環境調節因子失調，最終導致造血功能衰竭[7，8]，而調節CD4+T、CD8+T細胞免疫平衡的關鍵因素是Treg。研究證實，Treg是一類具有免疫調節作用的CD4+CD25+T淋巴細胞亞群，能有效抑制CD4+T細胞增殖，減少炎性細胞因子分泌，進而維持自身免疫耐受[9,10]。研究[3,9～12]表明，SAA患者外周血循環中Treg數量和功能均存在顯著異常。Kordasti等[10]研究發現，SAA患者Treg數量低于輕型再生障礙性貧血患者以及正常人群，并且正常人群CD4+T細胞功能不能被SAA患者Treg所抑制。但是，目前研究重點為SAA患者體內Treg分布及對其他T細胞亞群的影響，尚未有臨床報道Treg與SAA患者預后的關系[13]。本研究通過觀察SAA患者外周血Treg和CD4+T細胞、CD8+T細胞百分比的變化，并探討了其與預后的相關性，以此為臨床進一步改善SAA患者預后提供循證依據。

本研究結果顯示，SAA患者存在T細胞免疫異常，初治期SAA患者體內的CD4+T細胞、CD4+T/CD8+T高于緩解期患者，而CD8+T細胞低于緩解期患者，與既往研究[14,15]結果一致，表明SAA患者CD4+T細胞占主導地位，免疫平衡向正向調控偏移，促進免疫細胞增殖與分化；初治期SAA患者Treg百分比及Treg/CD4+T低，提示SAA患者體內Treg的數量及功能均被抑制，沒能起到免疫調節功能。國外研究[16,17]顯示，SAA發病機制中主要環節為Treg百分比降低，并且Treg百分比與SAA患者病情程度呈正相關，監測Treg水平能有效評估SAA患者病情變化。進一步研究[18,19]分析顯示，初治期患者體內血清的IL-10、IL-35以及TGF-β水平低，而這些細胞因子均是Treg分泌的主要細胞因子，能顯著抑制CD4+T細胞活性，提示SAA患者體內的Treg免疫功能被顯著抑制。對SAA患者體內Treg百分比與CD4+T細胞、CD8+T細胞以及網織紅細胞百分比進行相關分析，結果顯示Treg百分比與CD4+T細胞百分比及CD4+T/CD8+T呈負相關，與網織紅細胞百分比呈正相關，提示SAA患者體內Treg數量和造血系統恢復有較強相關性，其中的具體調控機制值得繼續進行深入研究。進一步應用多元Logistic回歸分析，結果顯示Treg百分比及Treg/CD4+T與SAA預后有關，表明升高Treg百分比及Treg/CD4+T可能可有效改善SAA患者預后。

綜上所述，與緩解期SAA患者比較，新發SAA患者外周血Treg百分比降低。外周血Treg百分比升高提示SAA患者預后良好。Treg細胞及Treg/CD4+T可用于監測SAA患者細胞免疫功能、評估臨床預后。然而本研究的納入病例較少，故此結論仍需要大樣本多中心的臨床試驗來證實。