癲癇伴抑郁大鼠杏仁核腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子及其受體酪氨酸激酶受體B的表達(dá)觀察

楊鈞哲,許新煒,朱含笑,程莉晶,李云

(1大理大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院,云南大理 671000;2大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院)

癲癇伴發(fā)抑郁(EAD)是一種常見的神經(jīng)精神疾病。癲癇是神經(jīng)系統(tǒng)常見的疾病，抑郁是現(xiàn)代社會(huì)較為嚴(yán)重的精神問題。EAD發(fā)病率呈逐年遞增趨勢(shì)，癲癇發(fā)作程度及其所造成的損傷是導(dǎo)致抑郁發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素[1]。抑郁嚴(yán)重影響了癲癇患者的日常生活及社會(huì)功能，也給家庭及社會(huì)帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。已有研究認(rèn)為，癲癇和抑郁存在潛在共同發(fā)病機(jī)制，但其具體發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚。因此，積極探索該病的發(fā)病機(jī)制及相關(guān)因素至關(guān)重要，對(duì)臨床有效防治EAD具有重要意義。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)是神經(jīng)生長(zhǎng)因子家族的重要成員，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)許多區(qū)域表達(dá)，通過與其特異性高親和力受體酪氨酸激酶受體B(TrkB)結(jié)合，發(fā)揮較強(qiáng)的促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、維持神經(jīng)細(xì)胞存活和正常生理功能的作用[2]。BDNF及其受體TrkB參與損傷神經(jīng)元的再生、發(fā)育，并參與突觸重塑和神經(jīng)遞質(zhì)傳遞的功能；BDNF能夠影響成熟神經(jīng)元的興奮性，癲癇過程中BDNF水平明顯上調(diào)，提示BDNF可能在癲癇發(fā)生機(jī)制中具有重要作用[2，3]。有研究發(fā)現(xiàn)，抗抑郁藥物可以提高BDNF水平、促進(jìn)神經(jīng)元再生，并增加神經(jīng)元突觸的可塑性來發(fā)揮抗抑郁作用，改善抑郁患者的臨床癥狀，提示BDNF及其受體TrkB在抑郁癥的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮了不可替代的作用。本課題組前期的研究[3]發(fā)現(xiàn)，BDNF及其受體TrkB在腦卒中后抑郁發(fā)病中具有重要作用。現(xiàn)有研究提示，BDNF在癲癇及抑郁發(fā)病中均有作用，但其在EAD發(fā)病中的作用尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。2017年12月～2018年4月，我們觀察了EAD大鼠杏仁核BDNF及其受體TrkB蛋白表達(dá)的變化，以探討二者與EAD發(fā)病的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑及儀器 健康清潔級(jí)成年雌性SD大鼠52只，體質(zhì)量(250±50)g,由昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物質(zhì)量合格證：SYXK(滇)2005-0004。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處置符合大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院關(guān)于使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。Western blotting試劑：兔抗鼠β-actin 1∶1 500(一抗)、兔抗鼠抗體BDNF 1∶500(一抗)、兔抗鼠抗體TrkB 1∶1 000(一抗)、羊抗兔IgG抗體1∶500(第二抗),均購(gòu)自CST公司；ECL試劑盒購(gòu)自福建博特生物科技有限公司。免疫組化實(shí)驗(yàn)試劑BDNF及TrkB兔抗單克隆抗體購(gòu)自Abcam公司；熒光二抗DylightTM594標(biāo)記的羊抗兔IgG(發(fā)紅色熒光)購(gòu)自KPL公司。

1.2 動(dòng)物分組及EAD模型建立、鑒定 采用Open-field法將健康成年SD大鼠52只隨機(jī)分為對(duì)照組、癲癇組、抑郁組和EAD組，每組13只。抑郁組：采用慢性不可預(yù)見的中等應(yīng)激刺激(CUMS)結(jié)合孤養(yǎng)法建立大鼠慢性應(yīng)激抑郁模型。癲癇組采用文獻(xiàn)[3]方法建立氯化鋰-匹羅卡品癲癇模型，癲癇發(fā)作行為評(píng)分采用Racine評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)：未有任何反應(yīng)；Ⅰ級(jí)：面部抽搐，包括節(jié)奏性咀嚼、動(dòng)須等；Ⅱ級(jí)：在Ⅰ級(jí)的基礎(chǔ)上加節(jié)律性點(diǎn)頭動(dòng)作；Ⅲ級(jí)：在Ⅱ級(jí)的基礎(chǔ)上加前肢肌陣攣發(fā)作，但無(wú)后肢直立位；Ⅳ級(jí)：在Ⅲ級(jí)基礎(chǔ)上加后肢直立位；Ⅴ級(jí)：全面性強(qiáng)直—陣攣發(fā)作，肢體失去控制。大鼠出現(xiàn)Ⅳ級(jí)以上的癲癇大發(fā)作為癲癇造模成功標(biāo)準(zhǔn)。于造模后第14天對(duì)癲癇模型進(jìn)行抑郁篩選，EAD大鼠為EAD組，癲癇未伴抑郁者為癲癇組。EAD造模成功標(biāo)準(zhǔn)：大鼠出現(xiàn)Ⅳ級(jí)以上的發(fā)作時(shí)間大于60 min以上，大鼠毛發(fā)明顯失去光澤，體質(zhì)量減輕，蜷縮活動(dòng)減少，自發(fā)活動(dòng)和探究性活動(dòng)減少，提示EAD模型建立成功。對(duì)照組：大鼠常規(guī)飼養(yǎng)。在造模成功后第1、8、15、29天，監(jiān)測(cè)4組大鼠體質(zhì)量、進(jìn)行蔗糖水消耗實(shí)驗(yàn)及曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行抑郁行為評(píng)價(jià)。蔗糖水試驗(yàn)：各組大鼠在造模后第1、8、15、29天，每隔1周進(jìn)行禁水24 h，測(cè)定禁水24 h后的第1 h內(nèi)動(dòng)物飲用1%蔗糖溶液的量(蔗糖溶液的飲用量反映了大鼠對(duì)獎(jiǎng)賞的快感反應(yīng))。曠野試驗(yàn)：擬用敞箱長(zhǎng)寬均為100 cm、高為50 cm，內(nèi)空的立柱體，壁周為黑色，地面用黑線劃分為面積相等的25塊。以動(dòng)物穿越地面方塊數(shù)(四爪跨入)作為水平活動(dòng)得分(反映大鼠的運(yùn)動(dòng)活動(dòng)性水平)，以直立次數(shù)(兩前肢離地1 cm以上)為垂直活動(dòng)得分(反映其興趣減少程度)。行為學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)果顯示：各組大鼠CUMS前、后不同時(shí)間體質(zhì)量比較，EAD組、抑郁組與對(duì)照組、癲癇組相比較，在CUMS后第29天，肉眼觀大鼠體型瘦弱，體毛失去光澤，蜷縮少動(dòng)，快感缺乏，自發(fā)性探究活動(dòng)減少。應(yīng)激后不同時(shí)間各組大鼠體質(zhì)量、蔗糖溶液消耗量、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)水平運(yùn)動(dòng)距離及垂直運(yùn)動(dòng)距離比較大鼠體質(zhì)量減少、蔗糖溶液消耗量降低、大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)水平運(yùn)動(dòng)距離、垂直運(yùn)動(dòng)距離縮短(P均<0.05);在CUMS后第29天，抑郁組、EAD組大鼠以上各指標(biāo)較CUMS后1、8、15天降低(P均<0.05)，詳見表1，進(jìn)一步說明EAD模型建立成功。

1.3 各組大鼠杏仁核BDNF及TrkB蛋白的檢測(cè) 各組大鼠分別于造模成功后第29天取材，采用活體灌注取腦法取腦組織。①免疫熒光染色法檢測(cè)杏仁核BDNF及TrkB蛋白：每組取8只大鼠，用3.6%水合氯醛(1 mL/100 g)腹腔麻醉，用生理鹽水從左心室灌洗后，灌注4%多聚甲醛，斷頭取腦，于冠狀面上切取大鼠大腦杏仁核0.5 cm，用冰凍石蠟切片機(jī)連續(xù)冠狀切片，片厚8 μm，切片放于0.1 MPBS中浸泡固定24 h備用。按試劑盒說明書步驟操作，最后采用激光共聚焦微鏡拍照，在每只動(dòng)物杏仁核區(qū)選擇高倍視野(HPF，400X)，計(jì)數(shù)BDNF和TrkB陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量。②Western blotting法檢測(cè)杏仁核BDNF及TrkB蛋白：每組取5只大鼠，麻醉后迅速活體取腦，根據(jù)大鼠解剖立體定向圖譜于冠狀位上切取0.5 cm厚的杏仁核約100 mg，置EP管中，-80 ℃冰箱保存。按試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作，最后計(jì)算條帶的積分吸光度(IOD)值表示BDNF及TrkB蛋白相對(duì)表達(dá)量。

表1 各組大鼠不同時(shí)間體質(zhì)量、蔗糖溶液消耗量、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)水平運(yùn)動(dòng)距離及垂直運(yùn)動(dòng)距離比較

注：與對(duì)照組同時(shí)間比較，▲P<0.05；與癲癇組同時(shí)間比較，▽P<0.05。

2 結(jié)果

各組大鼠BDNF和TrkB陽(yáng)性細(xì)胞發(fā)紅色熒光，BDNF陽(yáng)性產(chǎn)物定位在神經(jīng)元胞質(zhì)及突起根部，細(xì)胞核無(wú)染色；TrkB陽(yáng)性細(xì)胞產(chǎn)物定位在神經(jīng)元胞質(zhì)，細(xì)胞核無(wú)染色。與對(duì)照組和癲癇組比較，EAD組大鼠杏仁核BDNF和TrkB陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少(P均<0.05)，見表1。與對(duì)照組和癲癇組相比，EAD組杏仁核BDNF及TrkB蛋白表達(dá)量減少(P均<0.05)，見表2。

3 討論

杏仁核結(jié)構(gòu)功能復(fù)雜、纖維聯(lián)系廣泛，參與了情感行為的形成、內(nèi)分泌整合過程，其結(jié)構(gòu)及功能改變與抑郁情緒的產(chǎn)生關(guān)系密切[4～6]。抑郁患者存在杏仁核容積縮小[4]，EAD模型大鼠杏仁核存在明顯的神經(jīng)元凋亡，可見杏仁核與EAD發(fā)生關(guān)系密切。近年研究發(fā)現(xiàn)，EAD的作用機(jī)制可能與神經(jīng)突觸可塑性異常有關(guān)。BDNF為一種重要的營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞的蛋白質(zhì)，主要存在于海馬、皮質(zhì)下、杏仁核組織。BDNF對(duì)神經(jīng)元的分化、修復(fù)以及再生具有重要作用，其可以通過與TrkB結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)功能作用，如改善突觸可塑性、使受損傷后神經(jīng)元再生及參與認(rèn)知、學(xué)習(xí)、情緒等方面的功能調(diào)節(jié)等。BDNF可長(zhǎng)期調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的突觸可塑性：一方面，BDNF能增加Ras同源基因家族成員A(RhoA)蛋白水平,而RhoA可促進(jìn)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的重組和樹突蛋白的合成,調(diào)節(jié)突觸可塑性[7]；另一方面,BDNF可調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)元及突觸中的蛋白酶體活性,從而使突觸內(nèi)的蛋白質(zhì)處于相對(duì)平衡狀態(tài),以此來調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸可塑性[8]。TrkB是BDNF的高親和力受體，廣泛存在于神經(jīng)系統(tǒng)中，參與神經(jīng)元生長(zhǎng)、發(fā)育過程，引起突觸傳遞及可塑性調(diào)節(jié)。杏仁核中BDNF及其受體TrkB是否在EAD中發(fā)揮作用未見相關(guān)報(bào)道。

表1 各組大鼠杏仁核BDNF及TrkB陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) 比較(個(gè)/視野，

注：與對(duì)照組對(duì)比，aP<0.05；與癲癇組對(duì)比，bP<0.05。

表2 各組大鼠杏仁核BDNF及TrkB蛋白相對(duì)表達(dá)量 比較

注：與對(duì)照組對(duì)比，aP<0.05；與癲癇組對(duì)比，bP<0.05。

BDNF與抑郁癥的發(fā)生存在著關(guān)聯(lián)。研究[3]顯示，抑郁癥患者杏仁核中BDNF的高親和力受體TrkB明顯降低。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果[9]顯示，TrkB激動(dòng)劑可明顯改善由脂多糖導(dǎo)致的大鼠海馬區(qū)CA3結(jié)構(gòu)區(qū)損傷、減少杏仁核p-TrkB表達(dá)、下調(diào)樹突密度，從而發(fā)揮抗抑郁作用。鄭蕾等[10]研究發(fā)現(xiàn)，母愛剝奪的成年大鼠海馬和杏仁核BDNF及TrkB蛋白水平下降，導(dǎo)致了應(yīng)激相關(guān)的抑郁癥狀發(fā)生。臨床一線抗抑郁藥物可以通過提高BDNF水平促進(jìn)神經(jīng)元再生，并增加神經(jīng)元突觸的可塑性來發(fā)揮治療效果，從而改善患者的臨床癥狀。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，抑郁組及EAD組杏仁核BDNF及TrkB表達(dá)均低于對(duì)照組，抑郁組與EAD組BDNF、TrkB比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示在抑郁大鼠中杏仁核BDNF、TrkB表達(dá)降低，且杏仁核BDNF、TrkB降低也可能提示EAD的發(fā)生。

BDNF及其受體TrkB在癲癇發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用。BDNF能使神經(jīng)元產(chǎn)生興奮，癲癇過程中BDNF水平明顯升高[11]。在癲癇杏仁核結(jié)構(gòu)中，顆粒細(xì)胞BDNF蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，而且BDNF受體TrkB蛋白表達(dá)也增加[12，13]。文獻(xiàn)[14]報(bào)道，BDNF與苔癬纖維出芽(MFS)的關(guān)系密切，直接注射BDNF于成年大鼠腦內(nèi)(海馬、杏仁核、額前皮質(zhì)等)可以誘發(fā)MFS，從而使大鼠出現(xiàn)癲癇樣癥狀；癲癇可促使腦組織中苔蘚纖維BDNF上調(diào)。通過過度刺激L型鈣通道，可以引起顆粒細(xì)胞表達(dá)BDNF，激活TrkB受體可以引起腦內(nèi)(海馬、杏仁核、額前皮質(zhì)等)MFS現(xiàn)象，從而誘發(fā)癲癇發(fā)作[15]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，癲癇組杏仁核BDNF、TrkB表達(dá)升高，EAD組杏仁核BDNF、TrkB表達(dá)降低，提示癲癇大鼠中杏仁核BDNF、TrkB表達(dá)升高，二者表達(dá)降低可能預(yù)示EAD的發(fā)生。

總之，與癲癇大鼠比較，EAD大鼠杏仁核BDNF及TrkB表達(dá)均降低，二者表達(dá)降低可能提示EAD發(fā)生。但本研究樣本量少，后續(xù)研究需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，以進(jìn)一步驗(yàn)證此結(jié)論。