奧拉西坦腹腔注射后缺氧缺血性腦損傷新生大鼠海馬組織形態變化及NFP、CRMP-2表達觀察

張洋，王顯鶴，吳祥紅

(佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江佳木斯154003)

缺氧缺血性腦損傷(HIBD)是一種彌漫性腦損傷， 腦缺氧缺血后神經細胞凋亡，神經元功能和結構異常[1]。海馬是大腦邊緣系統的重要組成部分、是HIBD損傷中最敏感的部位之一,海馬損傷可直接導致空間記憶和學習能力下降[2]。奧拉西坦是一種新的環狀3-羥基-4-氨基丁酸衍生物，可作用于大腦皮層和海馬組織，保護、激活或促進神經細胞功能的恢復,起效迅速，擁有良好的耐受性和安全性，臨床效果顯著[3]，但其對HIBD起治療作用的病理及分子機制仍不明確。研究[4]發現，HIBD時，有眾多分子通過多種途徑參與神經元再生或壞死過程，其中Rho信號通路是重要信號傳導通路之一,坍塌反應介導蛋白-2(CRMP-2)是Rho通路下游底物分子，是一種抑制分子，屬于CRMPs家族代表性成員，其可通過調節細胞骨架形態抑制或促進神經元再生。NFP是反映神經元和突觸功能狀況最敏感的指標，也是構成神經細胞骨架的重要成員之一[5]，在NFP蛋白合成、轉運、磷酸化過程中，任何一個環節出現問題，可致使軸突的結構和功能嚴重受損，繼而導致神經元退化和死亡。2018年3～10月，本研究參照Rice法建立新生大鼠HIBD模型，觀察了奧拉西坦作用后HIBD新生大鼠海馬組織形態學及NFP、CRMP-2表達的變化，以探討其對神經元起保護作用的機制。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑、儀器 120只清潔級7日齡Wistar大鼠(由佳木斯大學動物實驗中心提供)，雄性或雌性，體質量(12.5±3)g，在室溫22 ℃，濕度50%條件下常規鼠飼料喂養；混合氣體(氮氣：92%，氧氣：8%，佳木斯市金鼎氧氣廠)；奧拉西坦注射液(廣東世信藥業有限公司)；CRMP-2抗體(英國Abeam公司)；NFP抗體(北京中杉金橋生物技術有限公司)；SABC(兔IgG)試劑盒(武漢博士得生物工程有限公司)；磷酸鹽緩沖液、枸櫞酸鹽抗原修復液、DAB顯色液、抗體稀釋劑(北京中衫金橋生物技術有限公司)；自制氧艙及水浴槽、CY-12C便攜式測氧儀(上海龍托儀器設備有限公司)；HC-TP12A-1架盤藥物天平(北京醫用天平廠)；石蠟切片機(沈陽市龍首電子儀器有限公司)；攤烘烤片機(上海艾測電子科技有限公司)；病理石蠟包埋機HD-310(湖北慧達儀器有限公司)；全自動生物組織脫水機(湖北歐美萊醫療科技有限公司)；NiKon E100顯微鏡(尼康儀器北京有限公司)。

1.2 Wistar大鼠分組、HIBD模型制備、奧拉西坦腹腔內注射 120只7日齡Wistar大鼠按隨機數字表法分為對照組、模型組和治療組，每組40只。對照組大鼠僅手術分離左頸總動脈，并且未進行永久性結扎，不做低氧處理。模型組大鼠經乙醚麻醉后，于頸部正中切口，分離并結扎左側頸總動脈，將動物靜置2 h，并置于含有8%氧氣的密閉容器中2 h，制備成HIBD模型。將出現左旋夾尾或夾尾左旋者納入實驗，缺氧后10 min腹腔注射生理鹽水0.1 mL/kg。治療組于模型制備成功后6 h、12 h、24 h、72 h、7 d分別腹腔注射100 mg/kg奧拉西坦注射液。

1.3 大鼠海馬組織形態學觀察及其CRMP-2、NFP蛋白檢測 分別于模型制作成功后6 h、12 h、24 h、72 h、7 d處死大鼠，每個時間點處死8只。每組新生大鼠用乙醚吸入麻醉，直立固定在手術板上， 開顱手術取腦組織，置于4%多聚甲醛中72 h。在腦組織下沉后，取出并石蠟固定，儲存在4 ℃冰箱中。以冠狀位的視交叉后約1 mm為第一切點，冠狀位后約3 mm處為第二切點，將固定好的大腦標本切成約5 mm×5 mm×5 mm的組織塊，然后流水洗滌過夜，梯度乙醇脫水，二甲苯浸漬蠟，放入盛有蠟溶液的鋁制包埋盒中，迅速冷卻凝固后去除鋁制包埋盒，用石蠟切片機將蠟塊連續切割成薄片，片厚約5 μm，切片的范圍從出現前聯合處開始到出現副海馬體為止，然后經展片、撈片、烤片后保存備用。進行HE染色觀察各組大鼠海馬組織形態學變化。采用免疫組化染色法檢測大鼠海馬組織CRMP-2和NFP蛋白,參照武漢博士德SABC-AP試劑盒說明步驟操作。隨機選擇每個切片5個非重復區域，在400倍顯微鏡下計數CRMP-2和NFP陽性細胞數目，計算平均值。結果判定：CRMP-2和NFP陽性細胞的胞質被染成棕褐色或棕黃色。

2 結果

2.1 各組大鼠海馬組織形態學變化 對照組各時點海馬組織結構完整、細胞層次清晰，核仁明顯，胞質均勻，細胞間連接緊密，無水腫、壞死。模型組在模型建立成功后6 h細胞無明顯改變；模型建立成功后12～24 h時細胞水腫，胞質疏松，淡染空殼，神經元數目減少，排列紊亂；模型建立成功后72～7 d細胞核固縮、裂解，炎性細胞增多，可見液化壞死灶伴膠質細胞增生及點狀出血。治療組在各時點大部分神經元腫脹，間質水腫較模型組明顯減輕，胞質及胞核較清晰，神經細胞水腫及核固縮數目明顯少于同時點模型組，腦組織開始修復。

2.2 各組大鼠不同時點海馬組織NFP、CRMP-2表達比較 對照組大鼠海馬組織NFP表達很少；模型組NFP在模型建立成功后6 h表現出少量表達，并在12 h開始下降，然后在24 h下降至最低，隨后逐漸增加,見圖1。治療組海馬組織NFP各時點NFP表達均高于模型組(P均<0.05),見表1。對照組大鼠CRMP-2在各時點表達量比較，P均<0.05。HIBD模型組CRMP-2表達量在模型建立成功后12 h時開始增加，在72 h時達到最高值，并在7 d后開始減少,見圖2。治療組中CRMP-2的表達在模型建立成功后12 h時開始增加，在24 h達到最高水平后，開始下降，治療組中CRMP-2各個時點的表達低于模型組(P均<0.05),見表2。

表1 各組大鼠不同時點海馬組織NFP表達比較

注：與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

表2 各組大鼠不同時點海馬組織CRMP-2表達比較

注：與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

圖1 不同時點各組新生大鼠NFP的表達

圖2 不同時點各組新生大鼠CRMP-2的表達

3 討論

新生兒HIBD為新生兒期危害最大的常見疾病之一，經常引起新生兒死亡和神經系統的發育障礙。在中國每年出生的新生兒中，有大約30萬患兒出現因HIBD引起的臨床后遺癥，導致腦癱、癲癇、智力低下、視聽障礙等永久性腦損傷以及不同程度的殘疾[4]。奧拉西坦在臨床治療HIBD方面取得較好療效，但其作用機制尚不明確，本研究以新生大鼠為研究對象，建立HIBD模型后給予奧拉西坦治療，并通過病理學觀察和免疫組化法探討其療效和作用機制。

NFP在動物成熟神經元和有髓鞘的軸突中廣泛存在，可保持軸突結構的穩定性，是神經元存活及發揮功能的必要蛋白[5]。NFP不僅起支持細胞、決定細胞形狀的作用,還參與一些細胞內和細胞外的能量轉換、物質轉運、細胞分化、細胞轉化、細胞器在細胞內分布及跨膜信號的傳遞等一系列重要生物過程[6]。有報道[6]顯示，NFP的表達與學習和記憶功能呈明顯正相關。本研究結果顯示，對照組大鼠NFP表達較少，模型組和治療組大鼠NFP表達升高;NFP在模型組和治療組中的表達均隨時間呈現先降低后升高的變化趨勢，但以治療組為著;提示奧拉西坦可提高HIBD大鼠NFP的表達，促進其神經功能的恢復，另一方面也說明大鼠機體有自我調節的功能，能夠自發上調NFP表達量，改善神經元功能，但這種作用與奧拉西坦相比明顯較弱。

CRMPs在中樞神經的發育過程中高度表達，分布在成年腦組織的神經元和少突膠質細胞中，與神經元的發育密切相關。有研究[7～11]顯示，CRMP-2是Rho、CDK5和GSK3的底物，參與生長錐的塌陷、軸突生長、缺血和阿爾茨海默病的發病等,CRMP-2在發育中的神經系統高表達，并在軸突生長導向中發揮重要作用。本研究結果顯示，對照組大鼠CRMP-2表達較模型組、治療組低，說明HIBD可使CRMP-2的表達量增加。本研究還發現，在每個時點，治療組CRMP-2的表達均低于模型組，與文獻[12,13]報道結論相符，說明奧拉西坦可通過下調CRMP-2的表達而對HIBD大鼠神經元起保護作用。此外，本次研究結果中模型組大鼠CRMP-2的表達在模型建立成功后72 h開始下降，而治療組在24 h開始降低，提示大鼠機體自身也有一定的自我恢復機制，但這種自我恢復機制的功能較弱，發生時間也較晚。

綜上所述，奧拉西坦可通過抑制CRMP-2表達、增加NFP表達，從而對HIBD新生大鼠的神經元起保護作用。大鼠機體自身對HIBD有一定的自我恢復機制，能夠在一定程度上降低HIBD造成的神經元損傷。目前關于CRMPs家族的研究不多，其家族的其他成員是否也參與HIBD的發生過程需進一步探討。