土家族腦卒中患者MTHFR、MTRR67基因單核苷酸多態(tài)性及其與血清同型半胱氨酸水平的關(guān)系

熊小平，譚小燕，馮云，楊章琴，李銳，田小龍

(重慶市黔江中心醫(yī)院，重慶409000)

腦卒中為腦血管破裂或閉塞后引起突發(fā)神經(jīng)功能缺損的一類臨床綜合征，是致殘致死率極高的疾病之一,分為缺血性腦卒中和出血性腦卒中[1]。腦卒中高危因素包括遺傳基因、高血糖、不良生活方式、高血壓、高脂血癥等，與心血管疾病高危因素相似[2]。研究證實，高同型半胱氨酸血癥為心血管疾病及腦卒中獨立高危因素[3]。亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)和蛋氨酸合成酶還原酶(MTRR)是葉酸代謝過程中的關(guān)鍵酶，其中MTHFR基因最常見突變位點為677、1298位[4～7]，MTRR基因最常見突變位點為66位，兩種基因不同位點突變均會導(dǎo)致血漿同型半胱氨酸水平升高。但是，MTHFR、MTRR基因突變與腦卒中的發(fā)病是否有關(guān)目前的研究結(jié)果尚無定論。另有研究[8]表明，MTHFR基因677位點的等位基因和基因型分布具有較強的地域和人種特征，突變型T等位基因頻率由低到高依次為非洲人、歐洲白人、中東人、中國漢族人、墨西哥。國內(nèi)研究[2，5，9]結(jié)果也顯示，不同民族、不同地區(qū)間MTHFR基因677、1298位點基因型分布存在明顯差異。重慶市黔江區(qū)為土家族聚集區(qū)，有獨特的民族特點，該地區(qū)腦卒中發(fā)病率也有逐年上升趨勢，目前尚無針對該民族腦卒中患者MTHFR、MTRR基因多態(tài)性研究,我們就該地區(qū)土家族腦卒中患者MTHFR、MTRR基因SNP及其與同型半胱氨酸水平的關(guān)系進行了探討。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2017年9月～2018年8月在黔江中心醫(yī)院住院治療的土家族腦卒中患者92例(腦卒中組),均符合《2016中國腦血管病診治指南及專家共識》中的腦卒中診斷標準。男49例、女43例，年齡(63±14)歲。糖尿病38例、高血壓72例，高血脂47例。病程<7 d。其中，腦出血9例，腦梗死68例，短暫性腦缺血發(fā)作15例。納入標準：年齡40～80歲；有明確的腦血管疾病的定位體征如偏癱、肢體麻木、失明、失語、吞咽困難、感覺障礙等；影像學檢查診斷明確。排除動脈瘤、血液系統(tǒng)疾病、腫瘤、外傷、心源性栓塞等疾病。選擇同期本院體檢健康土家族人員140例作為對照組，男88例、女52例，年齡(61±15)歲。納入標準：年齡40～80歲；無腦血管病病史；頭顱MR提示無腦卒中證據(jù)。兩組年齡、性別有可比性。

1.2 MTHFR、MTRR基因不同位點單核苷酸檢測及基因分型 ①DNA提取及擴增：采集受檢者口腔黏膜上皮脫落細胞，采用硅膠吸附法提取基因組DNA。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司使用HPLC純化方法合成。PCR反應(yīng)體系： 1 μL基因組DNA(20 ng/μL)，5 μL Taqman Universal Master Mix，0.5 μL Taqman-MGB探針(MTHFR677T/C GAAAAGCTGCGTGATGATGAAATCG[G/A]CTCCCGCAGACACCTTCTCCTTCAA；MTHFR 1298C/A AAGAACGAAGACTTCAAAGACACTT[G/T]CTTCACTGGTCAGCTCCTCCCCCCA；MTRR 66G/AAGGCAAAGGCCATCGCAGAAGAAAT[A/G]TGTGAGCAAGCTGTGGTACATGGAT)，3.5 μL去離子水，總反應(yīng)體積為10 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，92 ℃變性15 s，60 ℃延伸1 min，20個循環(huán)；89 ℃變性15 s，60 ℃延伸90 s，30個循環(huán)。②單核苷酸檢測及基因分型：將PCR擴增完成樣品置于ABI QuantStudio DX熒光定量PCR儀上讀取樣品孔的終點熒光，并使用QuantStudio DX Software分析軟件實現(xiàn)對MTHFR C677T的野生純合型(CC)、雜合型(CT)、突變純合型(TT)，MTHFR A1298C的野生純合型(AA)、雜合型(AC)、突變純合型(CC)與MTRR A66G的野生純合型(AA)、雜合型(AG)、突變純合型(GG)的SNP分型，相關(guān)儀器及試劑均購于美國AB公司。

1.3 血清同型半胱氨酸水平檢測 空腹條件下采集血液2 mL至ED-TAK3抗凝管中，于3 000 r/min、4 ℃離心機中離心10 min(采血后1 h內(nèi)完成離心)，分離上層血漿。采用高效液相色譜法檢測血清同型半胱氨酸，檢測值> 15 μmol/L定義為高同型半胱氨酸血癥。

2 結(jié)果

2.1 兩組MTHFR基因677、1298位點及MTRR基因66位點基因型、等位基因分布比較 兩組各基因型頻率均符合Hardy-Weinberg平衡(MTHFR基因677位點：χ2分別為0.028、0.13，P均>0.05；MTHFR基因1298位點；χ2分別為0.02、0.23，P均>0.05；MTRR基因66位點：χ2分別為5.07、2.98，P均>0.05)，具有群體代表性。MTHFR基因667位點等位基因分別為CC、TT、CT；兩組基因型及等位基因分布比較差異無統(tǒng)計學意義(χ2分別為1.32、1.08，P分別為0.25、0.58)，結(jié)果詳見表1。MTHFR 1298位點等位基因分別為CC、AA、AC型；兩組基因型及等位基因分布比較差異無統(tǒng)計學意義(χ2分別為0.49、0.77，P分別為0.48、0.68)，結(jié)果詳見表2。MTRR基因66位點等位基因分別為AA、AG、GG型。與對照組相比，腦卒中組MTRR基因66位點GG基因型比率上升，AG基因型比率下降(χ2=15.13,P<0.01;χ2=5.58,P<0.05)；兩組等位基因分布比較，χ2=0.96，P=0.33；結(jié)果詳見表3。MTHFR基因677、1298位點及MTRR基因66位點SNP與腦卒中發(fā)生無明顯相關(guān)性(OR分別為1.13、1.06、1.25，95%CI分別為0.81～1.58、0.58～1.91、0.79～1.99；P均>0.05)。

表2 兩組MTHFR 1298位點基因型及等位基因分布

表3 兩組MTRR基因66位點基因型及等位基因分布

2.2 MTHFR基因677、1298位點及MTRR基因66位點不同基因型腦卒中患者血清同型半胱氨酸水平比較 232例受試者MTHFR基因677位點基因型為CC、TT、CT者血清同型半胱氨酸水平分別為(14.36±0.78)、(24.67±5.59)、(15.12±0.69)μmol/L；MTHFR 1298C/A基因型為CC、AA、AC者血清同型半胱氨酸水平分別為(14.14±2.13)、(18.08±1.58)、(13.23±0.77)μmol/L；MTRR基因66位點基因型為AA、AG、GG者血清同型半胱氨酸水平分別為(15.23±0.87)、(16.45±1.95)、(21.84±5.13)μmol/L。MTHFR基因677位點TT基因型血清同型半胱氨酸水平高于CC、CT基因型(P均<0.05)。MTHFR基因1298位點及MTRR基因型66位點不同基因型之間血清同型半胱氨酸水平相比差異均無統(tǒng)計學意義(F1=2.16,F2=1.67;P均>0.05)。

3 討論

MTHFR基因定位于染色體1p36.3[4]，其突變可導(dǎo)致酶需熱性和活性減低，主要功能為催化5，10-亞甲基四氫葉酸還原為5-甲基四氫葉酸，其基因突變會導(dǎo)致同型半胱氨酸復(fù)甲基化障礙，使得血清同型半胱氨酸濃度升高，從而導(dǎo)致多種疾病發(fā)生。目前MTHFR基因多態(tài)性與缺血性腦卒中關(guān)系存在爭議[10,11]，一部分研究[12]認為該基因與腦卒中發(fā)病有關(guān)，甚至與兒童卒中發(fā)病也存在一定關(guān)系；但另一部分研究[13]認為，MTHFR基因突變與腦卒中發(fā)病無關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，腦卒中患者MTHFR基因677位點TT基因型同型半胱氨酸水平高于CC、CT基因型，說明MTHFR基因677位點TT基因型與高同型半胱氨酸血水平有關(guān)；但是，MTHFR基因677、1298位點SNP與腦卒中之間無明顯相關(guān)性。表明雖然MTHFR基因677位點突變可能降低亞甲基四氫葉酸還原酶的活性，引起同型半胱氨酸升高，但并非腦卒中的高危因素，與文獻[14]報道結(jié)果一致。本研究結(jié)果顯示，卒中組MTHFR基因1298位點各基因型分布與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義，不同基因型之間血清同型半胱氨酸水平相比差異均無統(tǒng)計學意義，且與腦卒中發(fā)生無關(guān)聯(lián)，與文獻[15]報道相似。說明MTHFR基因1298位點突變可能與高同型半胱氨酸血水平及腦卒中發(fā)生無關(guān)。

MTRR為蛋氨酸代謝中的一個關(guān)鍵酶，基因錯義突變是引起此酶缺乏或活性降低的主要原因,其中66位堿基突變最常見，其主要作用是維持血漿同型半胱氨酸濃度，66位點基因變異可引起血漿同型半胱氨酸濃度升高[16～18]。文獻報道，朝鮮族及漢族MTRR基因66位點GG基因型頻率分別為11.11%及5.03%，朝鮮族人群中MTRR基因66位A突變?yōu)镚增加腦卒中風險。本研究中，黔江區(qū)土家族腦卒中患者MTRR基因66位點GG亞型頻率高達19.6%，高于文獻報道的朝鮮族及漢族，說明黔江區(qū)土家族該基因的分布具有自身民族特點，可能存在連鎖不平衡現(xiàn)象，需進一步研究證實。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，卒中組MTRR 66位點GG型基因比率上升，提示腦卒中患者MTRR 66位點GG基因型可能增加患者的卒中風險，但Logistic分析顯示該基因OR值為1.25，與腦卒中發(fā)生無關(guān)聯(lián)性，提示該基因可能不是腦卒中的獨立危險因素[19]。MTRR基因型66位點不同基因型之間血清同型半胱氨酸水平相比差異均無統(tǒng)計學意義，說明MTRR基因型66位點突變與高同型半胱氨酸水平無關(guān)。

總之，土家族腦卒中患者MTRR基因66位點GG基因型比率上升，AG基因型比率下降；MTHFR基因677位點TT基因型與腦卒中患者高同型半胱氨酸水平有關(guān)；MTHFR、MTRR基因SNP與腦卒中發(fā)生無關(guān)。鑒于本研究中納入的研究樣本偏少，可能存在實驗偏差，仍需進一步擴大樣本量以明確上述兩種基因SNP與高同型半胱氨酸水平及腦卒中的關(guān)系。