鹿茸多肽的制備生理活性及應用進展

姜 瑋，暢柯飛，張鐵華

（吉林大學食品科學與工程學院，吉林長春 130062）

鹿茸是脊索動物門、哺乳綱、鹿科動物馬鹿和梅花鹿的雄性未骨化密生茸毛的幼角[1]，按動物源分為馬鹿茸和花鹿茸。鹿茸是傳統的名貴中藥材，入藥歷史悠久，稱之為“東北三寶”之一。據中國藥典記載，鹿茸經炮制可為鹿茸片和鹿茸粉，味甘、咸，性溫，歸腎、肝經；具有壯腎陽、益精血、強筋骨、調沖任、托瘡毒等功效；主要用于治療腎陽不足、精血虧虛、陽痿滑精、宮冷不孕、贏瘦、神疲、畏寒、眩暈、耳鳴、耳聾、腰脊冷痛、筋骨痿軟、崩漏帶下、陰疽不斂等[2]。

1 國內外研究現狀

我國對于鹿茸的精深研究始于20世紀90年代末期，從之前鹿茸外觀的形態的研究轉入到鹿茸活性成分的制備[3]、鑒定和活性機理研究[4]，研究水平已處于細胞和分子生物學水平。

在CNKI中，以“鹿茸”為主題檢索，文獻截止時間為2018年12月14日，通過“指數”分析的學科分布顯示，鹿茸在“中藥學”學科的比例最高為32.36%，伴隨出現頻率較高的詞分別為鹿茸多肽、化學成分、藥理作用、含量測定、多肽。

以“鹿茸”為主題CNKI中檢索，研究的學科分布示意圖見圖1。

圖1 以“鹿茸”為主題CNKI中檢索，研究的學科分布示意圖

在web of science中，以“deer antler”為主題檢索，從圖1分析可以看出，國際對于鹿茸的研究從1999年開始趨于熱化。

以“deer antler”為主題在web of science中檢索，每年發表文獻數見圖2，以“鹿茸多肽”為主題CNKI中檢索，研究的學科分布示意圖見圖3。

圖2 以“deer antler”為主題在web of science中檢索，每年發表文獻數

圖3 以“鹿茸多肽”為主題CNKI中檢索，研究的學科分布示意圖

在CNKI中，以“鹿茸多肽”為主題檢索，文獻截止時間為2018年12月14日，發現鹿茸多肽在“中藥學”學科的比例最高為75.85%，伴隨出現頻率較高的詞分別為鹿茸、軟骨細胞等。在web of science中，以“deer antler和peptide”為主題檢索，總計檢索到相關文章278篇，2005年后研究趨于熱化，具體如圖2所示。

以“deer antler”and“peptide”為主題在web of science中檢索，每年發表文獻數見圖4。

圖4 以“deer antler”and“peptide”為主題在web of science中檢索，每年發表文獻數

2 鹿茸多肽的制備

鹿茸多肽是從鹿茸中分離得到的一類分子量在0.2～10 kDa具有生物活性的肽占干鹿茸的50%左右。鹿茸多肽的提取方式較多，有水或乙醇浸提[5]、緩沖溶液浸提、酶解提取等。為保證加工過程中鹿茸的活性和營養的最大保存，研究者采取了很多處理辦法，并申請了專利[6-9]。

2.1 溶劑浸提

鹿茸多肽傳統的獲取方式是煎煮和泡酒，并沿用至今，在日常生活中，很多家庭仍采用這種方式滋補。Jin H等人[10]研究了熱水和超高壓提取鹿茸多肽的方法，以得率為評價指標，熱水浸提最佳提取溫度90℃，提取時間20 h，料液比1∶29.34，提取率可達28.01%（W/W），糖醛酸為3.57 mg/g，葡聚糖為3.27 mg/g，唾液酸0.99 mg/g。超高壓室溫（25℃）提取最佳壓力200 MPa，提取時間30 min，料液比1∶30，提取率達4.99%（W/W），糖醛酸為2.37 mg/g，葡聚糖為1.77 mg/g，唾液酸0.74 mg/g。Z G Sui等人[11]采用中性氯化鈉溶液（0.15 mol/L，pH值7.0）、弱酸溶液（0.15 mol/L的乙酸溶液，pH值4.0）、弱堿溶液（0.15 M的甘氨酸——氫氧化鈉緩沖溶液，pH值10.0）依次提取。董萬超等人[12]十二烷基磺酸鈉、巰基乙醇研磨提取，離心取上清液，經電泳分離后，多肽的分子量處于17 000～117 500 Da。隨著科學技術的發展，現有采用高壓脈沖電場[13]、超高壓[14]、超聲[15]等技術進行輔助提取。

2.2 酶解法提取

徐明等人[16]用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶和復合蛋白酶水解鹿茸蛋白，以酶解度和多肽得率為指標，通過單酶和雙酶組合試驗發現，木瓜蛋白酶和復合蛋白酶的酶解效果最好，通過單因素試驗和正交試驗發現，其組合酶解的最適工藝條件為溫度48℃，pH值7.2，底物質量分數7.5%，酶與底物濃度比6 000 U/g，2種酶比例為1∶1，酶解時間4 h，在此條件下酶解度為32.5%，多肽得率為72.8%。王華等人[17]采用堿性蛋白酶Alcalase酶解新鮮成年梅花鹿鹿茸，以對O2-自由基清除率為指標，通過正交試驗優化，最適酶解條件為酶與底物質量比1∶150，底物與溶劑質量比1∶13，酶解時間60 min。張龍等人[18]采用堿性蛋白酶Alcalase酶解鮮鹿茸，降解率達到82%～93%，并就此申請了國家發明專利。

3 鹿茸多肽的氨基酸序列

鹿茸多肽與鹿茸的品種、采集部位、加工方式有關，不同品種的鹿茸成分含量存在差異，且同一品種鹿茸不同部位、不同加工方式的含量和種類也不相同[19]。

董萬超等人[12]對成年梅花鹿茸的化學成分有較全面的分析，采用氨基酸自動分析儀檢測含有11種游離氨基酸17種以上的酶解氨基酸，并測出了部分鹿茸多肽的分子量17 000，17 500，18 500，95 500，112 000，117 500 Da。李繼海[20]采用pH值3.5的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，浸泡梅花鹿茸勻漿過夜、離心，取上清液、醇沉，獲得粗提物，經Sephadex G-50層析和CM-Sepharose Fast Flow柱層析得到一種活性多肽，SDS-PAGE電泳測得該肽分子量為3 200 Da，蛋白質含量達79.8%，主要含丙氨酸、谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸等15種氨基酸。張鄭瑤等人[21]通過乙醇醇沉、CM-SepharoseFast Flow離子交換層析SephadexG-50凝膠過濾層析和反相高效液相色譜層析（RP-HPLC）等技術分離純化得到單體鹿茸多肽，SDS-PAGE電泳顯示一條帶，等電點PI=8.15，激光解析電離飛行時間質譜儀確定該單體多肽分子量為3 263.4，由32個氨基酸殘基組成的直鏈多肽，富含纈氨酸、賴氨酸、亮氨酸和甘氨酸，氨基酸序列為VLSATDKTNVLAAWGKVGGNAPAFGAEALERM，且顯示與來源于馬鹿茸的32肽（分子量3 216.0，氨基酸序列為VLSAADKSNVKAAWGKVGGNAPAFGAEALLRM） 具有相似的功能活性，推測出4個有差別的氨基酸殘基沒有位于該肽的活性中心。嚴銘銘等人[22]通過SephadexG-25層析、DEAE-SepharoseFast Flow離子交換層析和反相C18柱層析，得到主要含纈氨酸、亮氨酸、谷氨酸及脯氨酸的單一鹿茸多肽，氨基酸序列為EPTVLDEVCLAHGP，分子量為1 479.3。

已鑒定的部分鹿茸多肽氨基酸序列見表1。

表1 已鑒定的部分鹿茸多肽氨基酸序列

4 鹿茸多肽的功能活性

4.1 促進細胞增殖作用

翁梁等人[23]利用大鼠建立了皮膚機械損傷模型，3H-TdR摻入表皮細胞DNA合成為檢測手段。體外研究表明，馬鹿茸的總多肽含量為0.8，3.2 mg/g，膏劑外敷能夠加速皮膚修復，從模型中分離出表皮細胞和軟骨細胞；離體試驗結果表明，馬鹿茸總多肽和單體多肽能促進表皮細胞有絲分裂，并推測修復的機理是促進細胞增殖和分化。牛瓊等人[24]采用肌肉注射、創口外用及二者結合的方式，考查了鹿茸多肽對大鼠皮膚機械損傷的影響。結果發現，肌肉注射、創口外用二者結合的方式愈合速度最快、創口細菌數最少、創面肉芽組織羥脯氨酸含量最高，與對照組有顯著差異，創口外用的方式次之。王豐等人[25]通過陽離子交換層析、凝膠過濾層析、反相高效液相層析分離純化鮮馬鹿茸多肽，經SDS-PAGE電泳分析，該肽分子量約為3 500 Da。通過氨基酸組成分析，該肽主要含纈氨酸、丙氨酸、賴氨酸和甘氨酸，且N-末端氨基酸為纈氨酸，對大鼠乳鼠表皮細胞和BRL肝細胞具有明顯的增殖作用。張鄭瑤等人[21]采用3H-TdR摻入法，研究顯示梅花鹿茸多肽對原代培養的表皮細胞和軟骨細胞具有增殖作用，也能促進NIH3T3成纖維細胞株的分裂。嚴銘銘等人[22]采用MTT法研究了鹿茸多肽CNT14對HT22細胞具有特異性增殖作用，Swillc細胞（人結腸癌、乳腺癌細胞MCF-7）無增殖作用，從而推測其對阿爾茨海默病（老年性癡呆）具有治療作用。陳東等人[26]通過免疫組織化學染色檢測神經干細胞（NSCs） 分化為神經元和星形膠質細胞的狀況，結果發現鹿茸多肽在體外可明顯促進神經干細胞向神經元分化，體現出鹿茸多肽多因素、多因子的協同作用，且在一定濃度范圍內呈現劑量依賴性。

4.2 抗氧化作用

郝林琳等人[27]通過乙醇沉淀獲取馬鹿茸多肽，在8 mg/kg的腹腔注射劑量下，鹿茸多肽能明顯提高12月齡小鼠的SOD活性、降低MDA的含量，呈現出較強的抗氧化作用。王華等人[17]考查了鮮梅花鹿茸多肽（分子量小于800 Da）的抗氧化活性，在質量濃度為20 mg/mL時對超氧陰離子的清除率可達91.9%，質量濃度為10 mg/mL時，羥基自由基清除率達100%，呈現出劑量依賴關系；能夠阻止脂質過氧化，且具有一定的還原力。

4.3 抗疲勞作用

鹿茸多肽具有抗疲勞作用。郝林琳等人[27]通過游泳試驗發現，高劑量組（8 mg/kg） 比對照組的游泳時間延長了21.67 min。張睿等人[28]研究發現，鹿茸多肽能明顯延長小鼠負重游泳時間、降低小鼠血乳酸和血清尿素氮的含量、提高小鼠體內肝糖原和肌糖原的儲備量及運動后乳酸脫氫酶的活力，具有明顯的抗疲勞作用。X D Luo等人[29]研究發現，鹿茸多肽能顯著增加小鼠常壓缺氧存活時間、斷頭喘氣時間、爬桿時間和負重游泳時間，并能顯著降低游泳后血清乳酸的增加量。

4.4 免疫調節作用

郝林琳等人[27]通過對受試小鼠的E玫瑰花環、溶血素檢測和腹腔巨噬細胞吞噬功能檢測，發現試驗組小鼠的玫瑰花環成環率和巨噬細胞吞噬率顯著高于對照組，高劑量組的溶血素OD值與對照組顯著差異，表明鹿茸多肽具有免疫調節作用，且具有劑量依賴性。L Zhao等人[30]模擬胃消化系統提取，體外試驗發現所提取的鹿茸多肽組分對小鼠脾細胞具有增殖作用。夏彥玲[31]研究了鹿茸醇提物和鹿茸粉對小鼠化學性、藥物性、酒精性及免疫性肝損傷具有顯著保護作用，且鹿茸醇提物的保肝效果好于鹿茸粉組,并推測鹿茸醇提物的良好效果是由于含有較多的多肽，這增強了小鼠的免疫調節功能，抑制炎癥反應,減少肝組織TNF-α和IL等細胞因子的產生，從而對小鼠肝損傷起到了保護作用。

4.5 促骨生長作用

張洪長等人[32]探討了梅花鹿茸多肽對人骨髓間充質干細胞（human bone marrow mesenchymal stem cells，hBMSCs） BMP-2和Runx2表達的影響，發現鹿茸多肽可使hBMSCs中的堿性磷酸酶活性增強，促進hBMSCs增殖分化，上調hBMSCs中骨形態發生蛋白2和骨特異性轉錄因子2基因和蛋白的表達，并推測這可能就是鹿茸多肽對人骨髓間充質干細胞骨形成及骨代謝影響的分子調控機制之一。

5 鹿茸多肽的毒理學評價

研究者對鹿茸多肽進行了急性毒性、亞慢性毒性試驗、生殖毒性和致突變作用研究。急性毒性顯示鹿茸多肽沒有達到半數致死劑量[33]，屬實際無毒物質[34]。亞慢性毒性試驗顯示，在正常攝入量的25，50倍時，受試組的血常規和血清生化指標與正常對照組差異不顯著；在正常攝入量的100倍時，受試組的血常規和血清生化指標與正常對照組差異顯著。

宋述輝等人[35]研究了鹿茸酒（58°酒浸出物∶38°酒=1∶1 000）的小鼠遺傳毒性。研究發現，鹿茸酒組與38°酒組的小鼠精子畸變率呈現劑量依賴性關系，但二者之間沒有差異，推測鹿茸無小鼠精子致畸作用；發育試驗表明，鹿茸酒反而可有效降低38°酒對胎鼠存活、發育的影響；繁殖試驗發現，鹿茸酒在一定濃度下，可以減少38°酒對F0，F1小鼠的繁殖能力影響，促進F2雄仔鼠的生長發育。在Ames試驗、小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗和小鼠精子畸形試驗中均顯示鹿茸水提濃縮液沒有致突變作用[35]。這2個研究的試驗對象雖為酒、水浸出液，但浸出物中均含有鹿茸多肽。

6 鹿茸多肽的應用現狀

6.1 鹿茸多肽在食品行業的應用

目前，市場上關于鹿茸的產品主要為鹿茸片，屬于初加工產品，主要用于煲湯、泡酒，附加值不高。針對鹿茸精深加工的產品，也多為粉劑、膠囊、復合飲料[36]等。以“鹿茸”為發明名稱檢索，有效的授權發明專利79件。以鹿茸為原料研發產品，有火鍋底料[37]、藥酒[38-46]、保健中藥（制品）[47-48]、鹿茸片[49-51]、餅干[52]、酸奶[53]、果凍[54]、口服液[55-57]等。

已經市場化的含有鹿茸多肽的部分產品見表2。

6.2 鹿茸多肽在化妝品行業的應用

鹿茸在化妝品行業嶄露頭角，已有公司開發了鹿茸相關化妝品，如鹿茸養顏寶系列、鹿茸青春寶系列、鹿茸多肽系列，是目前針對鹿茸開發的最全的鹿茸化妝品加工公司，并申報了國家發明專利“一種用于皮膚美容保健的復合鹿茸多肽凍干粉與納米級緩沖微乳組合精華素及其制備方法”[58]，目前已經市場化含鹿茸多肽的化妝品鹿茸多肽緊致霜、鹿茸多肽保濕霜、鹿茸多肽抗皺霜、鹿茸多肽抗皺眼霜、鹿茸活性多肽因子組合(緊致型、提升型、抗皺型)、鹿茸多肽原液（提升型、抗皺型、緊致型） 和鹿茸多肽抗皺眼精華等。

表2 已經市場化的含有鹿茸多肽的部分產品

6.3 鹿茸多肽在醫藥行業的應用

目前，利用鹿茸的再生能力，已經在醫藥領域展開研究和應用，如傷口愈合[59]、抗炎、帕金森病等。新吉樂[60]探討了鹿茸多肽對1-甲基-4-苯基吡啶離子誘導的SH-SY5Y細胞急慢性損傷的保護作用，探討鹿茸多肽對帕金森病的治療可能性。還有通過考查脂多糖誘導巨噬細胞RAW264.7 NO的產生，研究了鹿茸多肽的抗炎活性。

7 結語

鹿茸在臨床上具有悠久的應用歷史，近年來關于鹿茸的研究也趨于白熱化，尤其是針對鹿茸多肽，如胰島素樣生長因子（IGF-1）等。然而，盡管目前已有很多文獻表明鹿茸極具潛力，無論在食品、醫藥、化妝品行業，但已市場化的鹿茸產品，尤其是鹿茸精深加工的保健產品仍然較少。究其原因，一是鹿茸開發的產品形式單一，受眾面較小；二是針對鹿茸蛋白及多肽的化學及藥理學方面的研究往往考查的是混合多肽，是宏觀的表現，沒有更進一步考查到底是什么活性肽起了作用，怎么起的作用。因此，運用現代生物技術分離多肽，尋找出具有代表性的生物活性物質，在此基礎上開發鹿茸功能性產品，具有十分廣闊的前景。