胃癌患者血清中RUNX3、P16 基因甲基化檢測與化療療效的關系

劉 潔 彭 微 龔宗躍 徐筱紅 劉 映

湖南中醫藥高等專科學校，湖南省株洲市 412000

胃癌是我國最為常見的惡性腫瘤之一，其發病率和死亡率逐年增加。胃癌早期癥狀不典型,臨床發現時多數患者已到中晚期，因此化療為治療胃癌的主要方法之一。順鉑是胃癌化療的常用藥品，然而化療耐藥性嚴重阻礙了化療效果的提高。

P16基因(CDKN2A)和RUNX3(Runt-relatedtranscriptionfactor 3)都是重要的抑癌基因，與多種腫瘤的發生、發展以及預后有密切關系。DNA異常甲基化可通過影響染色質結構以及影響抑癌基因的表達從而使腫瘤得以發生與發展。研究發現，在胃癌細胞中可通過RUNX3和P16的高甲基化使RUNX3和P16基因沉默，從而導致腫瘤細胞異常增殖[1-2]。另外研究也表明RUNX3和P16基因的失活和甲基化還和腫瘤細胞耐藥密切相關[3-5]。本課題組前期以胃癌細胞和耐藥細胞為研究對象，采用DNA甲基化芯片，對比分析兩種細胞DNA甲基化表達譜差異，并結合甲基化特異性PCR(MS-PCR)技術驗證最終篩選出與甲基化譜芯片結果一致的13種基因，RUNX3和P16基因就為其中的高甲基化基因。這些實驗結果提示DNA異常高甲基化(包括RUNX3和P16基因)在胃癌順鉑耐藥形成機制中可能起著重要作用。游離DNA為循環血中的核酸類物質，所有細胞內的核酸，血中游離的內源性脫氧核糖核酸和外源性DNA與RNA。血中游離DNA在腫瘤的早期診斷、治療方案確定、療效觀察、預后評估等方面具有重要潛在價值。抽取血中游離DNA進行檢測比檢測組織DNA方法簡便易行、創傷很小、速度快，這一技術在腫瘤防治中有巨大應用價值。本研究在課題組前期研究基礎上收集株洲市中心醫院胃癌患者41例化療前和化療后血清，抽提DNA,觀察RUNX3和P16基因啟動子甲基化狀態的變化，及其變化與化療療效的關系，探討胃癌患者血清中RUNX3和P16基因甲基化與化療療效是否有關，為臨床發現腫瘤多藥耐藥提供線索，也為闡明耐藥的表遺傳機制奠定一定的理論基礎。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集株洲市中心醫院2015年9月—2017年12月經病理組織和影像學檢查診斷為胃癌患者41例(男22例，女19例，年齡45～72歲，中位年齡58歲)。臨床分期為ⅡA期5例，ⅡB期14例，ⅢA期20例，ⅢB期2例。41例組織學類型確診為胃腺癌。術前均未接受過放化療及細胞分子靶向治療等任何治療。41例胃癌患者手術后進行順鉑+5-FU化療。在取得患者的知情同意后，采集患者化療前、后的外周血?；煼桨该?周重復1次，化療6個周期后進行療效評估。20名健康獻血者的血標本作為對照。

1.2 方法

1.2.1 血清標本的處理：41例胃癌患者化療前清晨空腹時抽取外周靜脈血5ml,化療6個周期后再次抽取，抽取后血清促凝管收集, 4℃下3 000g離心10min，留取血清2ml，放入-80℃保存備用。

1.2.2 血清總DNA的提取：采用DNA提取試劑盒(購于美國Promego公司)提取血清DNA。每份標本用500μl的血清，嚴格按照提取說明書進行操作，DNA提取后在-80℃保存。

1.2.3 DNA亞硫酸氫鈉修飾：取3μg DNA 樣品，溶于60μl水中，95℃ 水浴10min，立即放于冰??；加入 60μl 10M氫氧化鈉，加入亞硫酸氫鈉修飾液690μl，混勻后分裝到6個PCR管，每管約130μl；將3個PCR管放入PCR儀，運用下列程序進行亞硫酸氫鈉修飾反應(95℃20s，95℃10s，58℃20min，循環7次)，保存在4℃。

1.2.4 MS-PCR：使用 MethylPrimer Express 1.0 軟件設計RUNX3和P16基因甲基化和非甲基化上、下游引物，引物序列、目的片段大小，引物由上?？党缮锛夹g有限公司合成。PCR檢測，反應條件：95℃熱啟動5min;然后95℃ 45s,60℃ 45s,72℃ 40s,共40個循環;最后72℃延伸10min。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳后觀察結果。

1.3 療效評估標準 化療療效按照WHO制定的實體瘤客觀療效評定標準分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、疾病穩定(SD)、疾病進展(PD)。疾病總有效率RR為(CR+PR)%，CR或PR患者4周后復查CT、進行療效確認。

1.4 統計學方法 用SPSS15.0統計軟件進行處理，數據中樣本率的比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 化療前血清中RUNX3和P16基因甲基化檢測結果 對41例胃癌患者手術后化療前血清進行RUNX3和P16基因甲基化檢測，發現41例血清中RUNX3和P16基因啟動子區甲基化率分別為70.7%(29/41)和68.3%(28/41)，而20例健康獻血者未檢出基因甲基化，與胃癌患者外周血甲基化率差異有統計學意義(P<0.01)， RUNX3和P16基因聯合甲基化檢出率為75.6%(31/41)，比單項指標檢出率高。

2.2 化療前、后血清中RUNX3和P16基因甲基化表達變化 對41例患者抽取了化療前后2次血清進行比較，結果表明41例化療后血漿血清中RUNX3和P16基因甲基化率比化療前降低，RUNX3基因甲基化率差異無統計學意義，而P16甲基化率差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1和表1。

A B

圖1化療前后RUNX3、P16產物瓊脂糖電泳圖

注：圖A：化療前；圖B：化療后。M:甲基化 PCR 條帶;U:非甲基化PCR條帶。

表141例胃癌患者化療前、后血清中RUNX3、P16基因甲基化率分析(%)

2.3 血清中RUNX3和P16基因甲基化率與化療藥物療效的關系 應用順鉑+5-FU化療方案對41例胃癌患者進行6個周期化療?；熀髮?1例患者進行療效評估，RUNX3啟動子甲基化陽性患者化療后的疾病總有效率RR為(CR+PR)%為37.9%，而RUNX3啟動子甲基化陰性患者化療后的疾病有效率為75.0%，差異具有統計學意義(P<0.05)；P16啟動子甲基化陽性患者化療后的疾病總有效率RR為(CR+PR)%為39.3%，而P16啟動子甲基化陰性患者化療后的疾病有效率為76.9%，差異具有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2血清中RUNX3基因甲基化率與化療藥物療效的關系[n(%)]

3 討論

近年來胃癌的發病率和死亡率逐年增加，化療是治療胃癌的最主要手段之一，然而對化療的耐藥性使胃癌化療的療效大大降低。腫瘤細胞的耐藥機制到目前為止尚未完全清楚，因此如何提高腫瘤對化療藥物的敏感性，增加化療療效成為迫切需要解決的問題。

RUNX3和P16基因都為常見抑癌基因，研究表明在多種腫瘤(包括胃癌細胞)中RUNX 3和P16基因表達下調或沉默，從而導致腫瘤異常增生，其中DNA甲基化是這兩種基因失活的重要機制[1-2，6-7]。DNA異常甲基化可通過影響染色質結構及影響抑癌基因的表達從而使腫瘤得以發生與發展。多數腫瘤中存在抑癌基因高甲基化的情況，這與化療耐藥的形成關系密切。許多研究報道腫瘤去甲基化后可恢復腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，逆轉腫瘤對化療藥物耐藥性，預測腫瘤化療效果及預后[8-16]。我們前期工作證實胃癌癌細胞發生順鉑耐藥時，細胞基因組存在廣泛的DNA甲基化修飾改變(包括RUNX3和P16基因)。有研究已發現RUNX3和P16基因的甲基化和腫瘤細胞耐藥密切相關，可能影響腫瘤細胞對化療藥物的敏感性[3-5，17]。但甲基化在化療耐藥中的機制尚未完全明確。

本實驗表明，RUNX3和P16基因異常甲基化在胃癌患者血清DNA中可以檢測到，且二者聯合檢測可提高檢出率，而正常獻血者未檢出基因甲基化，說明RUNX3和P16基因甲基化與胃癌的發生發展有關。而另一方面研究發現胃癌患者化療后血漿血清中RUNX3和P16基因甲基化率比化療前降低，雖然RUNX3基因甲基化率化療前后差異無統計學意義(可能和標本量太少有一定關系)，但RUNX3和P16基因甲基化陽性組的化療總有效率要低于陰性組，且差異具有統計學意義。提示RUNX3和P16基因甲基化可能與胃癌化療療效存在相關性，在化療藥物耐藥中起到非常重要的作用，但其具體的耐藥分子機制有待進一步研究。