芽孢桿菌的生防活性及其發酵條件優化

劉瑩瑩， 曲甜甜， 張丹雨， 卜 寧

(沈陽師范大學， 遼寧 沈陽 110034)

土地荒漠化是我國乃至世界上最嚴重的生態環境災難。遏制和治理土地沙化，改善生態條件，維持并擴大人類的生存空間，實現經濟可持續發展已成為亟需解決的重要問題。目前，土壤荒漠化治理的方法中，微生物菌肥因具有諸多優勢而成為重要研究方向[1]。微生物是土壤生態系統中物質循環和能量流動的重要組成成分，而土壤中的芽孢桿菌(Bacillus)是一類重要的植物根際促生菌(plant growth Promoting rhizobacteria，PGPR)，因其具有較強抗逆性等生物學功能而成為生物菌肥研制和生物農藥開發的潛質菌源。筆者以從蒙遼交界沙化土壤中分離出2株芽孢桿菌STW-2和STW-64為菌源，前期研究鑒定STW-2為阿氏芽孢桿菌(Bacillusaryabhattai)；STW-64為巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)，測定菌株對植物病原菌的拮抗活性，并對菌株的發酵條件進行優化，以期為蒙遼交錯帶破碎化草地的植被恢復提供生物菌肥和生物農藥的研發菌源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試供菌株 試供芽孢桿菌：菌株SWT-2(阿氏芽孢桿菌Bacillusaryabhattai)和SWT-64(巨大芽孢桿菌Bacillusmegaterium)，均分離自蒙遼交界阜新彰武縣章古臺鎮的沙化土壤，由沈陽師范大學生命科學學院微生物實驗室提供。

植物病原真菌：玉米大斑病菌(Cornnorthernleafblight)、玉米彎孢葉斑病菌(CurvularialunataBoed)、玉米頂腐病菌(Pythiumspp)、玉米圓斑病菌(Drechsleracarbonum)、玉米穗腐菌(Maizeearrot)、玉米黑束菌〔Ustilagomaydis(DC)Corola〕、番茄灰霉病菌(botrytiscinerea)、蘋果霉心病-粉紅聚端孢菌(Applemoldycore)、辣椒疫霉病菌(phytophthoracapsici)、黃瓜花腐病菌(Stemrotofcucumber)、黃色鏈孢菌(HuangSelianPestalotiopsis)、甜瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum)、稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)、高粱靶斑病菌(LeafSpotinSorghum)、向日葵核盤菌(SunflowerSclerotiniasclerotiorum)，均由沈陽師范大學生命科學學院微生物實驗室提供。

1.1.2 培養基 牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、水1 000 mL、pH 7.0～7.2；PDA培養基(培養指示真菌)：土豆200 g、葡萄糖20 g、水1 000 mL、自然pH。

1.2 對植物病原菌的拮抗活性測定

分別將已活化的2株試供芽孢桿菌接種于牛肉膏蛋白胨液體培養基中，26℃、120 r/min發酵24 h，備用。用直徑為5 mm的濾紙片蘸取供試芽孢桿菌發酵液放置于新PDA平板中央。將已活化的植物病原指示菌分別接種于PDA平板培養基上，26℃培養7 d，在菌落邊緣選取直徑5 mm的菌餅，在距離濾紙片2 cm處等距離處放置3個植物病原菌菌餅，每個處理3次重復，以未接供試芽孢桿菌(無菌水)的處理為對照。接菌后26℃培養5 d，測量抑菌圈大小，計算抑菌率。抑菌率(%)=[r1-(d-r2)]/r1×100，其中，r1為兩病原菌心間距離，r2為菌心到病原菌垂直距離，d為菌心到病原菌心間距離。

1.3 菌株不同發酵條件的優化

1.3.1 培養時間 將2 株供試芽孢桿菌分別接種于牛肉膏蛋白胨培養液中，26℃、120 r/min培養18 h制備種子培養液，備用。以5%接種量將2供試芽孢桿菌種子培養液分別接種于含有50 mL牛肉膏蛋白胨培養液的150 mL三角瓶中，26℃、120 r/min培養，分別在0 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、90 h、102 h測定培養液的OD600值，以未接菌的牛肉膏蛋白胨培養液為空白對照，每個處理3次重復。以培養時間為橫坐標，以OD600為縱坐標繪制菌株生長曲線。

1.3.2 碳、氮源 最佳碳源：以不含碳源的牛肉膏蛋白胨培養液為基礎，分別加入葡萄糖、乳糖、蔗糖、淀粉、麥芽糖，以不加碳源的培養基為對照，分別接種1%的供試芽孢桿菌種子培養液，26℃、120 r/min培養16 h，測定培養液的OD600值，每個處理3次重復。最佳氮源：以不含氮源的牛肉膏蛋白胨培養液為基礎，分別加入蛋白胨、酵母浸粉、硫酸銨、硝酸銨、氯化銨，以不加氮源的培養基為對照，分別接種1%的供試芽孢桿菌種子培養液，26℃、120 r/min培養16 h，測定培養液的OD600值，每個處理3次重復。

1.3.3 無機鹽 以牛肉膏蛋白胨培養液為基礎，分別加入CaCO3、KH2PO4、NaCl、MgSO4，以不加無機鹽的培養基為對照，分別接種1%的供試芽孢桿菌種子培養液，26℃、120 r/min培養16 h，測定培養液的OD600值，每個處理3次重復。

1.3.4 初始NaCl濃度 以牛肉膏蛋白胨培養液為基礎，在含有0、0.5%、1%、1.5%、2%、3%、5%NaCl的培養液中分別接種1%的供試芽孢桿菌種子培養液，26℃、120 r/min培養16 h，測定培養液的OD600值，每個處理3次重復。

1.3.5 初始pH 以牛肉膏蛋白胨培養液為基礎，在初始pH為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12培養液中分別接種1%的供試芽孢桿菌種子培養液，26℃、120 r/min培養16 h，測定培養液的OD600值，每個處理3次重復。

1.3.6 正交試驗 以蔗糖為碳源、蛋白胨和酵母浸粉2個相近氮源、KH2PO4、pH作STW-2菌株的5因素4水平正交試驗；以葡萄糖為碳源、蛋白胨和酵母浸粉2個相近氮源、KH2PO4、pH作STW-64菌株的5因素4水平正交試驗，以確定2個菌株最優發酵條件。

2 結果與分析

2.1 菌株對植物病原菌抑菌活性

由表1可知，SWT-2菌株對蘋果霉心病菌、辣椒疫霉菌、黃色鏈孢菌、玉米穗腐菌、玉米圓斑菌5種植物病原菌具有抑菌活性；STW-64菌株對甜瓜枯萎病菌、蘋果霉心病菌、辣椒疫霉菌、黃色鏈孢菌、玉米穗腐菌、玉米圓斑菌6種植物病原菌有抑菌活性。STW-2、STW-64菌株的抑菌率均在35%以上，其中兩者對蘋果霉心病-粉心聚端孢(Applemoldycore)的拮抗活性最高，抑菌率分別為63.2%和64.2%。

表1 2株芽孢桿菌對植物病原菌的抑菌活性

注：表中數據為3 次重復的平均值。

Note: The data in the table were the average values of 3 replicates.

2.2 菌株的優化發酵條件

2.2.1 培養時間 由圖1可見，隨培養時間的增加，培養液的OD600值呈先升高后降低趨勢，菌株STW-2的OD600值在0～24 h內隨培養時間的增加而加大，菌數呈指數增長，在24 h時達到最大；24 h以后，OD600值隨培養時間的增加而減少，直至菌數不再增加，整個群體生長進入穩定期、衰亡期。菌株STW-64的OD600值在0～48 h內隨培養時間的增加而加大，菌數呈指數增長，在48 h時達到最大；48 h以后，OD600值隨培養時間的增加而減少，直至菌數不再增加，整個群體生長進入穩定期、衰亡期。

2.2.2 碳、氮源 從圖2可看出，STW-2菌株在以蔗糖為碳源時，菌株生長最好，且顯著高于其他碳源；以酵母浸粉為氮源時，生長最好，且顯著高于其他氮源。STW-64菌株在以葡萄糖為碳源時，菌株生長最好，以蛋白胨為氮源時，菌株生長最好。

圖2不同碳、氮源處理菌株的OD值

2.2.3 無機鹽 由圖3可見，氯化鈉對STW-2菌株的生長無顯著影響，而另外3種因素可顯著抑制其生長；對于菌株STW-64來說，氯化鈉和硫酸鎂能夠顯著促進其生長，碳酸鈣則顯著抑制其生長，磷酸氫二鉀對其無顯著影響。2株菌株均在NaCl為無機鹽的培養基中生長最好。

圖3不同無機鹽處理菌株的OD值

Fig.3 OD values of strains treated with different inorganic salts

2.2.4 初始NaCl濃度 由圖4所示，培養基中NaCl濃度對菌株生長有顯著影響。在鹽濃度小于3%時，STW-2和STW-64菌株的生長量隨著鹽濃度的變化而保持穩定，鹽濃度增加到5%時，生長量顯著下降，說明2種菌株生長受到影響，耐鹽的最大值為3%左右。

2.2.5 初始pH 由圖5可知，pH為4～5時，2株菌的菌體數量隨著初始pH的增大而加大，菌數呈指數增長，pH為6時達到最大；pH 為9～12時，2株菌的菌體數量隨著初始pH的增大而減少。

2.2.6 正交試驗 由表2可見，STW-2菌株發酵條件優化的影響因素，由R值得出碳源(葡萄糖)>pH>緩沖物質(磷酸二氫鉀)>氮源(蛋白胨)>氮源(酵母浸粉)；由K值可知：碳源的最適濃度為A3，最適pH為F3即為7，磷酸二氫鉀的最適濃度為D2，蛋白胨的最佳濃度為B2，酵母浸粉的最適濃度為C4。則STW-2菌株發酵培養基最好水平組合為A3B2C4D2E3，即：蔗糖0.3%，蛋白胨0.5%，酵母浸粉1.5%，磷酸二氫鉀0.5%，pH為7。STW-64菌株發酵條件優化的影響因素，由R值得出pH>緩沖物質(磷酸二氫鉀)>碳源(葡萄糖)>氮源(酵母浸粉)>氮源(蛋白胨)；由K值可知：碳源的最適濃度為A3，最適pH為F3即為7，磷酸二氫鉀的最適濃度為D2，蛋白胨的最佳濃度為B2，酵母浸粉的最適濃度為C3。則STW-64菌株發酵培養基最好水平組合為A3B2C4D2E3，即：葡萄糖0.3%，蛋白胨0.5%，酵母浸粉1.0%，磷酸二氫鉀0.5%，pH為7。

表2 STW-2與STW-64菌株菌株的正交試驗結果

3 結論與討論

以菌抑菌的生物防治方法不污染環境具有廣闊前景。芽孢桿菌是植物病害生防微生物的重要組成部分，具有顯著的生防潛力，能產生耐熱抗逆的芽孢，利于生防菌劑的生產、劑型加工及在環境中存活、定殖與繁殖[2]。目前用于生物防治的高效拮抗菌主要有芽孢桿菌類的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、多 粘 芽 孢 桿 菌(Paenibacilluspolymyxa)、蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)和短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)[3]。巨大芽孢桿菌是一種常見的多功能微生物，在土壤解磷、農藥降解、污水處理及生物堆肥等領域均有應用[4-5]。許愛玲等[6]采用平板對峙培養法測定了地衣芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌對棉花枯萎病菌和黃萎病菌均有明顯抑制作用；孫龍生等[7]對巨大芽孢桿菌BM1259的抑菌活性測定及體內拮抗試驗表明，巨大芽孢桿菌能顯著降低異育銀鯽腸道氣單胞菌的數量，提示巨大芽孢桿菌可作為潛在的水產專用微生態制劑。2009年，印度海德拉巴國家研究所發射帶低溫采樣器的熱氣球，分離出20～41 km平流層中芽孢桿菌新種，將其以印度天文學家阿耶波多的名字命名為阿耶波多氏芽孢桿菌(Bacillusaryabhattai)，簡稱阿氏芽孢桿菌[8]。阿氏芽孢桿菌J-6具有對人、畜、農作物安全和環境友好的特點，對煙草黑脛病防治有顯著效果[9]。從苜蓿根際分離出主要的株芽孢桿菌均能拮抗2種及以上供試植物病原真菌，同時具有不同程度的促生作用[10]。

研究的2株菌株通過平板對峙法檢測菌株對植物病原菌的抑菌情況，結果發現STW-2、STW-64菌株分別對5種和6種植物病原真菌具有明顯的拮抗活性，抑菌率均在49%以上，其中對蘋果霉心病-粉心聚端孢(Applemoldycore)的拮抗活性最高，抑菌率分別為63.2%和64.2%；這與許愛玲等[6]的研究結果相似，表明巨大芽孢桿菌和阿氏芽孢桿菌均有抑制植物病原菌生長的能力，均有生物防治有益菌的潛力，但未進行菌株提高抑菌能力的培養條件優化，此方面還有待后續深入研究，提高這2株芽孢桿菌的生物防治能力是關鍵。

發酵培養基的優化在微生物產業化生產中舉足輕重，是從實驗室到工業生產的必要環節。單因素試驗搭配正交試驗是培養基優化的一般方法。劉露等[11]通過單因素試驗優化巨大芽孢桿菌BM05的發酵條件，提高其發酵活菌數。王繼雯等[12]為了提高巨大芽孢桿菌C2產芽孢的形成率，采用單因素和正交試驗，通過搖瓶發酵培養，對影響巨大芽孢桿菌C2芽孢形成的發酵培養基成分和培養條件進行優化。該研究同樣采用單因素試驗與正交試驗結合的方法，優化2株芽孢桿菌的培養基，結果表明STW-2的最優培養基配方為蔗糖0.3%，蛋白胨0.5%，酵母浸粉1.5%，磷酸二氫鉀0.5%，pH為7，26℃，120 r/min；STW-64的最優培養基配方為葡萄糖0.3%，蛋白胨0.5%，酵母浸粉1.0%，磷酸二氫鉀0.5%，pH為7，26℃，120 r/min。為以后菌株投入工業化生產打下基礎。2株菌具有巨大的生物肥料、生物防治潛質并且有望在農業可持續發展中發揮促進作用，并對改善當地沙土地環境的有積極意義。