UV-B輻射強度對煙苗生長及抗氧化酶的影響

涂云，楊正聰，權(quán)佳鋒，蔡昊城，柳文鳳，楊東，任汝周，盧紅*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 煙草學(xué)院， 云南 昆明 650201； 2.云南中煙工業(yè)有限公司 技術(shù)中心， 云南 昆明 650202； 3.云南省煙草公司景東縣分公司， 云南 普洱 676200; 4.山東中煙工業(yè)有限責(zé)任公司 青島卷煙廠， 山東 青島 266000)

云南是我國最大的優(yōu)質(zhì)煙葉產(chǎn)區(qū)，煙草產(chǎn)業(yè)位居云南五大支柱產(chǎn)業(yè)之首，為當(dāng)?shù)亟?jīng)濟發(fā)展做出了重要貢獻[1]，且長年為全國重點骨干品牌提供原料。云南地處低緯度高原[2]，地理位置特殊，平均海拔1 894 m左右，紫外線強度位居全國前列。而波長280～320 nm的紫外光稱為UV-B區(qū)，UV-B紫外輻射對整個生物圈的植物影響最大，且隨著臭氧層空洞達到地球表面的輻射量也顯著增加。UV-B紫外輻射對植物形態(tài)及生物量的影響最顯著和直接的就是植株矮化，在煙草、小麥[3]、番茄[4]和黃瓜[5]等作物中均觀測到這一現(xiàn)象。朱素琴等[6]研究表明，UV-B脅迫對于植物的葉面積、葉片數(shù)、莖圍、主根長和側(cè)根數(shù)都有不利的影響，最終影響植物乃至植物群體的生物量。陳建軍等[7]通過對20個大豆品種研究發(fā)現(xiàn)，UV-B輻射降低了大豆根、莖、葉以及籽粒的生物量，最終各個品種大豆的總生物量均呈不同程度的下降，與MAZZA等[8]的研究結(jié)論一致。可能原因是植物通過改變自身形態(tài)從而減少UV-B輻射的影響。左敏等[9]研究發(fā)現(xiàn)，低劑量的UV-B輻射使煙株株高及主根長增長，莖稈變粗，說明低劑量輻射可能對煙苗的生長有利。對于植物的抗氧化性系統(tǒng)酶方面，歐陽磊等[10]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)UV-B照射后的煙葉，SOD及POD活性均顯著高于對照，而CAT活性呈先升后降趨勢。龍云等[11]報道，UV-B輻射使玉米幼苗的CAT活性下降，SOD活性呈先升后降趨勢，POD活性則明顯高于對照。蕎麥在經(jīng)過UV-B處理后，其PPO活性呈大幅度上升趨勢。張新永等[12]研究發(fā)現(xiàn)，2個馬鈴薯品種保護酶對UV-B輻射的敏感性存在差異。總體上看，植物抗氧化酶系統(tǒng)對UV-B輻射的響應(yīng)因種間和種內(nèi)差異具有一定的波動性。目前，大部分對于該方向的研究均采用大田栽培或者溫室盆栽方式進行，鮮見關(guān)于UV-B輻射對煙苗生長發(fā)育影響方面的研究報道。為此，通過人工模擬試驗，研究UV-B輻射強度對烤煙煙苗生長發(fā)育和抗氧化酶活性影響，為生產(chǎn)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

烤煙品種：K326和紅花大金元(以下簡稱紅大)，云南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院提供。

輻照燈管：UV-B燈多支(功率15 W，中心波長313 nm)，南京華強電子有限公司生產(chǎn)。

輻照檢測計：手持式單通道UV-B紫外輻照計，北京師范大學(xué)光電儀器廠。

1.2方法

試驗于2018年2月20日在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)稻作所溫室進行育苗(海拔1 900 m)，10 d后出苗，待苗齡30 d后通過懸掛UV-B燈管，調(diào)整燈管與煙苗的距離。分別設(shè)0μW/cm2(CK)、35 μW/cm2(T1)、60 μW/cm2(T2)、85 μW/cm2(T3)和110 μW/cm2(T4) 5個輻射強度處理，隨煙苗生育進程，通過調(diào)整該距離以保證各處理輻射強度前后一致。每日19:30-20:30照射60 min，12 d為1個周期，連續(xù)處理3個周期。育苗過程嚴(yán)格按照漂浮育苗技術(shù)規(guī)程進行。

1.3指標(biāo)測定

每個周期(12 d)選取各處理長勢基本一致的煙苗5株，測定其葉片抗氧化酶〔過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和多酚氧化酶(PPO)〕活性，3次重復(fù)，連續(xù)測定3個周期。POD測定采用愈創(chuàng)木酚法[13]〔以A470變化0.5/min為1個活力單位(U)〕，SOD測定參照文獻[14]的方法進行，采用氮藍四唑光化還原法〔以反應(yīng)中抑制百分率為50%時，定義為1個酶活力單位(U)〕，CAT測定采用紫外吸收法[13]〔以催化1 nmol/min H2O2降解定義為1個酶活力單位(U)〕，PPO測定參照文獻[15]的方法并加以改進〔以A525變化0.005/min為1個酶活力單位(U)〕。酶活性單位均表示為U/mg。

成苗后，隨機選取各處理幼苗10株，參照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YC/T 142-2010測定煙草農(nóng)藝性狀。隨后將煙苗置于70℃恒溫烘箱內(nèi)烘干至恒重，測定其總干重及根冠比。

1.4數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2013進行數(shù)據(jù)處理及繪圖，通過SPSS 19.0進行Duncan新復(fù)極差法多重比較以及Pearson相關(guān)性分析。

2結(jié)果與分析

2.1UV-B輻射處理對烤煙幼苗生長的影響

從表1可知，UV-B不同輻射強度處理K326和紅大各生長指標(biāo)的變化。K326：株高、最大葉面積及主根長T1～T4較CK均明顯下降，處理間差異顯著；莖圍T1與CK接近且相對最大，分別為1.58 cm和1.57 cm，二者差異不顯著，其余UV-B處理均顯著低于CK；總干重及根冠比較CK均顯著降低，各處理總干重較CK分別降低19%、49%、90%和177%，干物質(zhì)積累明顯減少。紅大：莖圍、主根長和根冠比T1～T4較CK均呈先升后降趨勢，均以T1最大，分別為1.46 cm、14.34 cm和15.76%，莖圍T1與CK及其余處理間差異顯著，主根長和根冠比T1與CK間差異不顯著。總干重T1～T4較CK分別下降12%、43%、113%和157%，降幅低于K326。總體上看，UV-B輻射使煙苗矮化，莖圍、葉面積和主根長顯著減少，但低劑量UV-B輻射可促使煙苗變粗壯，呈矮壯、緊湊的株型。UV-B輻射顯著降低煙株的生物量，根冠比較大的植株有利于應(yīng)對環(huán)境脅迫，2個烤煙品種的變化趨勢大致相同，但紅大表現(xiàn)出更強的適應(yīng)性。

表1UV-B輻射處理烤煙幼苗的生長情況

注：各品種同列不同大、小寫字母分別表示差異達極顯著水平(P<0.01)和顯著水平(P<0.05)。

Note: Different capital and lowercase letters in the same column indicate significant difference at 1% and 5% levels.

2.2 UV-B輻射處理對烤煙煙苗抗氧化酶活性的影響

2.2.1過氧化物酶(POD)從圖1看出，UV-B輻射處理2個烤煙品種POD活性較CK均顯著升高，且與輻射強度呈極顯著正相關(guān)。42 d時，UV-B輻射處理2個烤煙品種POD活性顯著高于CK，K326各處理間呈先升后降趨勢，T4的POD活性呈抑制作用；紅大POD活性隨著UV-B輻射的增強而升高，各處理間差異顯著。54 d時，紅大POD活性T4較CK增長5.76倍，而K326依次為T3>T4>T2>T1，其POD活性T3較CK增長3.98倍。66 d時，紅大各處理POD活性雖然仍顯著高于CK，但T3、T4較前一周期相同處理低。K326的T3和T4也較前一周期相同處理低。表明，烤煙POD對UV-B輻射響應(yīng)十分敏感，提高UV-B輻射強度可顯著提高烤煙POD的活性，但在高強度輻射且延長輻射時間又對POD活性具有抑制作用，而這種變化在不同品種間存在差異，紅大對UV-B輻射的響應(yīng)更為敏感，耐受閾值也高于K326。

2.2.2超氧化物歧化酶(SOD)從圖2可知，隨著UV-B輻射強度的增大，2個品種煙苗SOD活性變化趨勢有所不同。42 d時，UV-B輻射處理K326的SOD活性均顯著高于CK，且隨輻射強度增強而升高；紅大UV-B輻射處理也顯著高于CK，以T3的SOD活性最高。54 d時，UV-B輻射處理K326以T1的SOD活性最高，之后隨著輻射增強而降低；紅大以T3的SOD活性最高，T4顯著低于T2與T3。在66 d時，UV-B輻射處理K326以T1的SOD活性最高，之后開始下降，T3、T4顯著低于CK；紅大以T3的SOD活性最高，T2顯著高于CK，T4則顯著低于CK。總體上看，烤煙SOD對UV-B輻射響應(yīng)十分敏感，在UV-B照射前期，SOD活性均呈升高趨勢并顯著高于CK，但隨著UV-B輻射處理時間的延長，后期SOD活性顯著低于CK，K326其輻射臨界強度為35 μW/cm2(T1),紅大臨界強度為85 μW/cm2(T3)。表明紅大比K326對UV-B輻射強度的耐受性更強。

圖 1 UV-B輻射處理K326和紅大的過氧化物酶活性

圖 2 UV-B輻射處理K326和紅大超氧化物歧化酶(SOD)的活性

2.2.3過氧化氫酶(CAT)從圖3看出，42 d時，UV-B輻射處理2個品種CAT活性均顯著高于CK；K326，T3與T4間差異顯著，且二者與T1、T2間差異顯著，T1與 T2間差異不顯著；紅大，各輻射處理間無顯著性差異。54 d時，UV-B輻射處理K326以T3的CAT活性最大，呈先升后降的趨勢；紅大，隨UV-B輻射強度增強其CAT活性呈上升趨勢，各輻射處理間差異顯著，T4的CAT活性是CK的1.86倍，該時期K326與UV-B輻射強度相關(guān)性不顯著(r=0.231)，而紅大則與之呈極顯著正相關(guān)(r=0.947**)。66 d時，K326的CAT活性與UV-B強度呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.530*)，呈先升高后降趨勢，以T2的CAT活性最高，之后降低，同時低于上一個時期相同處理。紅大的CAT活性呈先升后降趨勢，以T3的CAT活性最高，T4顯著低于CK，但CAT活性與UV-B強度相關(guān)性不顯著(r=0.143)，且各輻射處理低于上一個時期相同處理，呈抑制作用。CAT是響應(yīng)UV-B輻射較為敏感的一類酶，短期處理時增長顯著，而處理時間延長，輻射強度增加的情況具有抑制作用，UV-B輻射對K326的CAT活性抑制效果較紅大明顯，其后期呈顯著的負(fù)相關(guān)。

圖3UV-B輻射處理K326和紅大的過氧化氫酶活性

2.2.4多酚氧化酶(PPO)從圖4看出，隨著UV-B輻射強度的增大，2個烤煙品種(K326的66 d時除外)PPO活性在整個處理時期均呈升高趨勢。42 d時，K326和紅花大金元PPO活性UV-B輻射處理均顯著高于CK，且均隨UV-B輻射增強而升高。54 d時，K326和紅大PPO活性UV-B輻射處理較CK分別升高23%、27%、40%、109%和52%、102%、144%、153%，其增幅紅大明顯大于K326；表明紅大對UV-B輻射的生理響應(yīng)力更強。66 d時，不同處理K326的PPO活性以T2最高，隨UV-B輻射強度的增大呈先升高后降低趨勢，但UV-B輻射處理均顯著高于CK。可能原因：隨著輻射時間的延長，K326在T3和T4輻射強度時已達其耐受閾值，從而呈下降趨勢；而紅大的PPO活性仍隨UV-B增強而升高，表明其對UV-B輻射的耐受性更強。

圖4 UV-B輻射強度K326和紅大的多酚氧化酶活性

3 結(jié)論與討論

3.1 UV-B輻射對烤煙農(nóng)藝性狀的影響

UV-B輻射已成為作物在自然環(huán)境下最常遭遇的環(huán)境脅迫，植物通過改變自身生長形態(tài)以適應(yīng)其環(huán)境脅迫[16]。試驗結(jié)果表明，低強度UV-B輻射2個品種煙苗矮壯，部分指標(biāo)優(yōu)于CK，這與CHOUDHARY等[17]的結(jié)論相符。高強度UV-B輻射后，各處理煙苗生長顯著低于CK。究其原因：UV-B破壞了植物內(nèi)源激素IAA，使其光降解，而IAA是促進節(jié)間伸長的關(guān)鍵激素，從而出現(xiàn)植株的矮化現(xiàn)象[18]。另外，高強度UV-B輻射在煙株莖圍、葉面積和主根長方面均較CK顯著降低，且隨著輻射劑量的加大，降幅明顯，形成了矮小、粗壯和緊湊的株型。另外，UV-B輻射顯著抑制煙株的生物量，輻射強度越強，煙苗的生物量越低，植株干物質(zhì)積累越少，但低強度UV-B輻射2個品種煙苗還維持了一定的根冠比，紅大略優(yōu)于CK。這些變化都是植物的應(yīng)激反應(yīng)，以此應(yīng)對環(huán)境脅迫，在番茄[4]、黃瓜幼苗[5]和水稻[19]等作物上均觀觀察到類似的變化。研究結(jié)果表明，在2個品種煙苗的生長方面，K326與紅大稍有不同，但總體趨勢一致，呈低促高抑趨勢，低強度的UV-B輻射可使煙株更為粗壯，生產(chǎn)上可通過適當(dāng)增補UV-B輻射培育壯苗，預(yù)防高腳苗。

3.2UV-B輻射對植物抗氧化酶的影響

趙天宏等[20]研究表明，UV-B脅迫可顯著提升植物的自由基水平，積累過多的O2-、OH-和H2O2等自由基，從而導(dǎo)致活性氧代謝系統(tǒng)的紊亂，活性氧損傷加劇，最終造成膜系統(tǒng)被破壞。植物的抗氧化酶系統(tǒng)通過一系列生理生化反應(yīng)，清除過多的自由基，使植物體內(nèi)的自由基維持其正常的生理水平，從而減輕或恢復(fù)UV-B脅迫造成的損傷。

POD是植物抗氧化酶系統(tǒng)中一類非常重要的氧化還原酶的統(tǒng)稱。楊暉等[21]研究發(fā)現(xiàn)，番茄幼苗的POD活性隨UV-B輻射的增強而上升。研究結(jié)果表明，UV-B輻射煙苗早期的POD活性也呈相同的趨勢，紅大增幅大于K326，表明紅大對UV-B輻射的生理響應(yīng)力更強。隨著處理時間延長，高輻射強度下煙苗的POD活性受到抑制，且低于上一個處理周期，總體呈先升后降趨勢，與李惠梅等[22]的研究結(jié)果一致。表明POD的雙重性：一方面，POD在逆境初期具有清除自由基的功效，表現(xiàn)出保護效應(yīng)；另一方面，POD在逆境后期參與活性氧的生成，引發(fā)膜脂化反應(yīng)，呈傷害效應(yīng)。SOD在植物體內(nèi)主要將O2-歧化為H2O和H2O2，以達到清除自由基的目的。劉敏等[23]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)UV-B輻射的煙葉SOD活性顯著上升，觀察其同工酶圖譜發(fā)現(xiàn)，各輻射處理相較CK增加1條同工酶譜帶，表明UV-B輻射使SOD活性上升是因為誘導(dǎo)了新的同工酶的表達。研究結(jié)果表明，2個品種煙苗SOD活性均呈先促后抑趨勢，前期變化趨勢與劉敏等的結(jié)論一致，后期則出現(xiàn)了抑制作用。究其原因：可能是長時間、高強度的UV-B輻射已經(jīng)對煙苗產(chǎn)生傷害效應(yīng)。另外，K326與紅大的輻射處理存在臨界強度，當(dāng)超過這一強度時，SOD活性即開始下降，呈抑制效應(yīng)，而紅大的臨界強度高于K326，表現(xiàn)出對UV-B輻射的耐受性更強。2個品種煙苗CAT活性呈處理前期升高后期下降的趨勢。究其原因：CAT具有猝滅H2O2自由基的作用，而H2O2是SOD歧化作用的產(chǎn)物之一，UV-B輻射脅迫下，煙株體內(nèi)積累了大量的O2-，誘導(dǎo)SOD活性升高，同時CAT的活性也隨之升高[24]，而在逆境后期，當(dāng)植株體內(nèi)的活性氧因UV-B輻射刺激而過度積累，導(dǎo)致其破壞植株活性氧系統(tǒng)的平衡，而對機體產(chǎn)生損害，使CAT的部分活性喪失，表現(xiàn)出下降趨勢。與施溯筠等[25]的研究結(jié)論相近，且還觀察到CAT同工酶譜上新的同工酶譜帶的生成。PPO活性在植物體內(nèi)能夠催化氧化多酚類化合物形成醌來抵御外界不良環(huán)境[15]。研究結(jié)果表明，紅大PPO活性在整個處理時期均呈上升趨勢，在前中期各處理K326的PPO活性也呈上升趨勢，但長時間高強度輻射下部分處理呈抑制作用，但仍顯著高于CK，2個品種間PPO活性存在差異；紅大對UV-B輻射的響應(yīng)能力和耐受性較K326更強，其耐受閾值更高。究其原因：紅大是云南省石林縣路美邑村煙農(nóng)從大金元的自然變異株中選擇[26]，經(jīng)云南省煙草科學(xué)研究所系統(tǒng)選育而成的優(yōu)良品種，選育過程需要能夠適應(yīng)云南省低緯、高海拔、強紫外線的生態(tài)環(huán)境，而K326是1985年從美國引進云南，所以紅大對UV-B輻射脅迫的適應(yīng)性優(yōu)于K326。另外，4種抗氧化酶對于UV-B輻射的響應(yīng)在不同時期和不同強度下存在差異，抗氧化酶在UV-B脅迫下的協(xié)同作用還有待進一步深入研究。