靶向LETMD1的miR-494對宮頸癌發病的作用

李 新，董立新，楊 森，曹麗艷，毛 羽，付占昭，董思奇

目前，宮頸癌已成為最常見的婦科惡性腫瘤之一，2012年全球共有新發病例近53萬例，病死率約為50%[1, 2]，且發病呈年輕化趨勢。因此，探索宮頸癌發生發展的潛在機制，以便實現宮頸癌的早期診斷和有效治療是十分必要的。LETMD1，又稱人宮頸癌基因(HCCR)，最早在宮頸癌組織中發現[3]，但LETMD1在宮頸癌中的上游調控機制目前尚未明確。MicroRNA(miRNA)是一種非編碼RNA，其主要通過與靶基因mRNA結合，誘導靶mRNA降解或翻譯抑制。目前有研究證實，miRNA參與腫瘤的發生發展，參與調控腫瘤的惡性生物學行為[4, 5]。本研究通過生物信息學分析和實驗證實過表達miRNA-494可靶向作用于LETMD1，進而抑制宮頸癌細胞的增殖，旨在對篩選出宮頸癌中靶向作用LETMD1的特異性miRNA有所幫助。

1 材料與方法

1.1 材料 選取2017-09至2018-03秦皇島市第一醫院診斷為原發性宮頸癌30例的組織標本。入選標準：(1)接受根治性子宮切除及盆腔淋巴結清掃術；(2)有完整臨床資料者；(3)接受手術獲取標本前未接受過放療或化療等治療；(4)簽署知情同意書。另選擇同期婦科良性疾病行全子宮切除的30例的正常宮頸組織標本進行對照。所有診斷均經病理科醫師證實。宮頸組織離體后馬上收取，置于凍存管中，-80 ℃冰箱保存直至使用。所有組織標本使用均獲得醫院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 miR-494靶基因預測 通過 TargetScan、miRanda等基因預測網站預測miR-494靶基因。

1.2.2 細胞培養 實驗所用宮頸癌細胞株(HeLa和SiHa)購自上海生物化學與細胞生物學研究所。培養箱培養條件為37 ℃恒溫，5%CO2。

1.2.3 qRT-PCR 使用TRIzol試劑(Invitrogen，美國)從宮頸癌組織、正常宮頸組織和宮頸癌細胞株(HeLa和SiHa)中提取總RNA，并應用紫外分光光度計進行純度檢測。cDNA第一條鏈應用Mir-X miRNA First-Strand Synthesis and SYBR qRT-PCR Kit(Takara，日本)說明書操作合成，合成的cDNA作為模版進行qRT-PCR擴增。所有 PCR 反應都在 Light Cycler480 定量 PCR 系統(Roche Molecular Systems，美國)中進行。miRNA-494及LETMD1 mRNA的相對表達量通過2-ΔΔCT法計算，分別以U6和GAPDH作為內參，引物來自上海生工公司。

1.2.4 細胞轉染 空白對照(NC mimic)、miR-494 類似物(miR-494 mimic)、miRNA-494抑制物(miR-494 inhibitor)及空白對照(inhibitor-NC)由廣州Ribobio公司進行設計合成。宮頸癌細胞株首先在6孔板中培養至密度達4×105/孔，融合率超過70%時，再進行轉染。使用Lipofectamine 2000轉染試劑(Invitrogen，USA)單獨轉染miRNA-494 mimic、inhhibitor，及其各自陰性對照(NC mimic和inhibitor mimic)。

1.2.5 質粒構建 FulenGen (廣州，中國)公司設計合成載體質粒(pReceiver -M98-LETMD1)，空白對照為空載體質粒(pReceiver -M98)。Ribobio公司 (廣州，中國)設計合成小干擾RNA (siRNA LETMD1)。空白對照為錯義寡核苷酸 siRNA。質粒和 siRNA 均應用Lipofectamine 2000(Thermo Fisher，美國)轉染細胞。

1.3 雙熒光素酶實驗 轉染前1 d將細胞接種在 24 孔板中培養至細胞數量達 1×105/孔，保證鋪板率達70%。之后將野生型質粒(Wt vector)和突變型質粒 pGL3-LETMD1-3’UTR-Mt vector，即 Mt vector以及相應的miRNA-494 mimic或者miR494 inhibitor或LETMD1 siRNA應用Lipofectamine 2000進行共轉染。在進行熒光素酶實驗中，將加入含海參熒光素編碼基因的pRL-Tk質粒(Promega，美國)作為內參。

1.4 Western blotting實驗 從培養皿中刮下細胞，加入含有新鮮蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液中，冰浴30 min充分裂解。4 ℃，12 000 r/min，離心10 min,獲上清液，使用BCA蛋白質測定試劑盒(Pierce，美國)測定總細胞蛋白質濃度。通過SDS-PAGE分離出等量蛋白質，然后在低溫下轉移至PVDF膜。用5%脫脂奶粉對膜進行封閉后，將膜與一抗(antiLETMD1和抗GADPH)一起孵育。沖洗后，將膜在過氧化物酶連接的抗兔IgG(Icllab，美國)中溫育，最后使用化學發光(Millipore，美國)使其可視化。用Bio-Rad凝膠系統(Bio-Rad，美國)對印跡進行定量。通過Imgae J軟件分析相關圖像灰度值。

1.5 克隆形成實驗 將細胞接種于6孔板中，在37 ℃，5% CO2的恒溫培養箱中連續培養14 d。細胞集落用無水甲醇固定15 min并用結晶紫染色后20 min進行細胞克隆數計數。

2 結 果

2.1 宮頸癌病理特征與miRNA-494表達情況 通過宮頸癌組織中miRNA-494表達情況與患者臨床病理特征的相關性，發現miRNA-494與宮頸癌患者FIGO分期呈明顯相關(P<0.05，表1)，而與患者年齡、分化程度、SCC水平差異無統計學意義。

表1 30例宮頸癌的病理特征與miRNA-494表達情況統計表

2.2 miRNA-494在宮頸癌組織和正常組織的表達 采用qRT-PCR技術檢測miRNA-494在宮頸組織中的表達。結果顯示，與正常宮頸組織相比，宮頸癌組織中miRNA-494的表達水平明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05，圖1)。

2.3 LETMD1 mRNA和蛋白質在宮頸癌組織和正常組織的表達 應用qRT-PCR及Western blotting技術檢測LETMD1 mRNA及蛋白質在宮頸組織中的表達，結果顯示，與正常宮頸組織相比，宮頸癌組織中LETMD1 mRNA和蛋白質的表達水平均有明顯升高，差異具有統計學意義(P<0.05，圖2)。

圖1 miR-494在宮頸癌組織與正常宮頸組織中的表達

圖2 宮頸癌組織與正常宮頸組織LETMD1表達差異比較

2.4 miRNA-494靶向于LETMD1 mRNA的驗證 為進一步明確miR-494對LETMD1 mRNA靶向性，我們將LETMD1 mRNA 3’UTR連接于質粒上，形成pGL3-LETMD1-3’UTR-Wt vector(野生型)；通過定點突變試劑盒將預測的miR-494與LETMD1 mRNA結合位點進行定點突變構建(預測結合區域)，見圖3，形成pGL3-LETMD1-3’UTR-Mt vector(突變型)。相關miR-494 mimic及其對照共轉染pGL3-LETMD1-3’UTR-Wt vector后，與NC mimic 相比，miR-494 mimic可顯著抑制熒光強度(①P<0.01)，而miR-494 inhibitor共轉染后，可使熒光強度與NC inhibitor相比稍有上升(②P<0.05)。而共轉染pGL3-LETMD1-3’UTR-Mt vector后，各組差異無統計學意義，見圖4。

圖3 miR494與LETMD1 mRNA3’UTR預測結合位點

圖4 miR-494靶向結合于LETMD1-3’UTR預測靶序列

2.5 miRNA-494通過靶向LETMD1抑制宮頸癌細胞增殖 集落形成實驗結果顯示，對比轉染mimics NC組，轉染miRNA-494 mimics的Hela細胞系和SiHa細胞系增殖能力均顯著減弱(P<0.01)；而對比轉染inhibitor NC組，轉染miRNA-494 inhibitor的細胞系增殖能力明顯增強(P<0.01，圖5)。

圖5 miR494對宮頸癌細胞系克隆形成能力的影響

A.miR494對宮頸癌Hela細胞系克隆形成能力的影響；B.miR494對宮頸癌SiHa細胞系克隆形成能力的影響；①表示兩組比較，P<0.05

3 討 論

近年來發現，LETMD1是與人類多種腫瘤發生發展、放化療敏感性及預后密切相關的基因。除在宮頸癌細胞系中，也在乳腺癌和胰腺癌等多個腫瘤中高表達[6, 7]。有研究發現，通過調控降低LETMD1的表達，能夠顯著降低上述腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲等惡性生物學行為[8]，LETMD1還可增加胃癌患者對化療藥物氟尿嘧啶的敏感性，這表明LETMD1可能成為腫瘤治療的新靶點[9]，此外，LETMD1也被證實可作為除甲胎蛋白(AFP)外，也可診斷肝腫瘤和判斷預后的一種生物標記物[ 10]。

miRNA-494是一種來源于染色體14q32.31的miRNA[11]，其在包括結直腸[12]、肺癌[13]、胰腺癌[14]及乳腺癌[15]等多個腫瘤中異常表達，其在不同的腫瘤中通過作用不同的分子靶點來參與腫瘤的發生發展及預后。在宮頸癌中，有報道稱，miRNA-494是明顯低表達的，并發現其異常表達參與宮頸癌細胞的惡性生物學行為，并發現通過表達miRNA-494能夠顯著抑制宮頸癌細胞的增殖、遷移和侵襲[16, 17]。最近的一項研究發現，miRNA-494可以通過細胞信號傳導抑制因子6(SOCS6)機制參與宮頸癌的發生發展[18]。本研究選取miRNA-494作為LETMD1上游的調控因子，結果發現，miRNA-494通過靶向作用于LETMD1 mRNA進而對宮頸癌的惡性生物學行為進行負向調控。

本研究首先通過檢測宮頸癌組織及正常組織中miRNA-494的含量，對比臨床病理特征后發現miRNA-494與FIGO分期呈明顯相關，而與年齡、分化程度、SCC水平無關。隨后我們通過表達和敲降實驗觀察宮頸癌細胞系中的LETMD1 mRNA和蛋白質的情況，并以此來驗證負相關。為進一步證明兩者之間的靶向關系，本研究利用雙熒光素酶報告實驗證實了LETMD1 mRNA的3’-UTR為miRNA-494的直接靶標。最后，通過體外細胞實驗證實了過表達的miRNA-494可通過靶向作用于LETMD1進而抑制宮頸癌細胞的增殖。

總之，本研究結果表明，miRNA-494通過直接靶向作用于LETMD1抑制宮頸癌細胞的增殖。這一發現不僅幫助我們了解宮頸癌發生發展的分子機制，為進一步研究miRNA-494作為宮頸癌的潛在生物標記物和治療靶點提供了一定的證據，下一步我們將擴大樣本，進行更深入地研究。