基于代謝網絡技術的補陽還五湯對APP/PS1雙轉基因小鼠干預作用的研究

汪白云 楊柳 劉國良 樸成玉 李慶偉 薛慧 劉斌

[摘要] 目的 基于代謝靶標角度揭示補陽還五湯對APP/PS1雙轉基因小鼠的調節機制。方法 選取20只7月齡APP/PS1雙轉基因小鼠為研究對象，建立阿爾茨海默病模型。將APP/PS1雙轉基因小鼠隨機分為2組，即模型組和補陽還五湯組（9.26 g/kg）;另選取10只健康的BALB/c小鼠作為空白組。補陽還五湯組灌胃給予補陽還五湯，空白組及模型組給予生理鹽水。連續灌胃35 d后進行Morris水迷宮實驗，測定小鼠學習記憶能力。在此基礎上，采用高通量液相色譜質譜聯用技術對各組小鼠尿液進行全面分析，通過終端代謝產物回溯疾病發展過程中的關鍵代謝酶或代謝通路，聚焦APP/PS1雙轉基因小鼠的發病機制以及補陽還五湯的作用機制。 結果 Morris水迷宮實驗中，與空白組比較，模型組穿越平臺次數明顯減少（P < 0.01），補陽還五湯組穿越平臺的次數顯著增加（P < 0.01）、在目標象限的停留時間顯著增加（P < 0.01）。空間定位航行實驗中，補陽還五湯組較模型組的逃避潛伏期明顯縮短（P < 0.01）。通過進一步尿液代謝軌跡分析發現，各組小鼠尿液聚類良好，空白組和模型組間分離明顯，補陽還五湯組則處于兩組間。通過分組貢獻較大的差異離子分析發現其主要分布在鞘脂代謝和脂肪酸代謝。給予補陽還五湯后上述代謝通路明顯呈回調趨勢。經高分辨質譜鑒定獲取了4個代謝異常的生物標志物，分別是花生四烯酸、神經胺、L-棕櫚酰肉毒堿、甘油磷脂酰膽堿。通過組學數據處理平臺Metaboanalyst 4.0的在線分析可知其主要涉及兩種代謝通路，分別是鞘脂代謝和花生四烯酸代謝。 結論 補陽還五湯對阿爾茨海默病小鼠作用明顯，可有效改善其學習記憶能為。調節氨基酸代謝及能量轉化可能是其調節阿爾茨海默病的關鍵機制。

[關鍵詞] 補陽還五湯;阿爾茨海默病;代謝組學;通路;機制

[中圖分類號] R289.5? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）03（b）-0013-05

阿爾茨海默病（Alzheimer′s disease）是臨床上常見的神經系統退行性疾病，其主要病理特征為β-淀粉樣蛋白沉積所形成的老年斑及神經元丟失，近年來其發病率逐漸升高[1]。此外，阿爾茨海默病的發病機制尚不明確，且臨床上確證有效的藥物極少，因此阿爾茨海默病發病機制和有效藥物亟待進一步深入研究[2]。近年來轉基因實驗動物逐漸成為研究阿爾茨海默病的焦點，其具備自發性代謝調控致阿爾茨海默病的特點，且病理機制和行為特征與阿爾茨海默病患者極為相似，是公認的現階段研究阿爾茨海默病的最佳動物模型。但由于其價格過高，因此其應用范圍存在一定的局限性。本研究選取APP/PS1雙轉基因小鼠為研究對象，并基于高通量的尿液代謝組學技術獲取轉基因小鼠的代謝數據，為阿爾茨海默病的發病機制研究提供依據。

補陽還五湯出自清代王清任所著《醫林改錯》，具有補氣、活血、通絡之功效。大量研究[3-10]表明，補陽還五湯能顯著降低大鼠β-淀粉樣蛋白含量，改善腦部血液流變量，緩解動脈粥樣硬化。本研究在評價APP/PS1雙轉基因小鼠空間探索能力和定位能力的基礎上，采用代謝組學技術從代謝徑路水平探究其發病機制，以期為補陽還五湯干預作用的藥效機制研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

1.1.1 主要儀器? Q-ExactiveTM（美國Thermo Fisher Scientific公司）;ML-T分析天平（瑞士梅特勒托利多）;VDUPL超純水機（九方沃德科技有限公司）;Morri水迷宮（安徽淮北正華生物儀器有限公司）。

1.1.2 主要試藥? 生黃芪（批號：131109）、當歸尾（批號：131001）、赤芍（批號：121003）、川芎（批號：20140501）、地龍（批號：121002）、桃仁（批號：20140401）、紅花（批號：130901），經黑龍江中醫藥大學佳木斯學學院周忠光教授鑒定均為正品。補陽還五湯水煎液由田明教授制備，水煎液經冷凍干燥制備成干粉（出粉率是34.11%，1 g干粉相當于生藥量2.93 g），并保存于干燥器中，備用。

1.1.3 補陽還五湯處方組成? 生黃芪120 g、當歸尾6 g、赤芍4.5 g、川芎3 g、地龍3 g、桃仁3 g、紅花3 g。

1.2 動物

選取雄性7月齡APP/PS1雙轉基因小鼠20只，體重（40±10）g，建立阿爾茨海默病小鼠模型;雄性7月齡清潔級BALB/c小鼠10只，體質量（30±10）g。實驗動物由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物合格證號：NO.211002300013 027。實驗開始前，小鼠在動物室中適應7 d，并采用標準實驗室水及食物喂養，動物室保持在22～26℃，相對濕度（50±5）%，暗/光循環12/12 h。

1.3 動物分組及代謝樣本制備

20只APP/PS1雙轉基因小鼠根據體重數值按隨機數列方法分為2組，即模型組和補陽還五湯組，每組10只。另選10只BALB/c小鼠作為空白組。空白組和模型組每天自由飲食和飲水，補陽還五湯組連續35 d灌胃給予9.26 g/kg的補陽還五湯[9]。實驗第35天收集夜尿12 h，于4℃下以轉速10 000 r/min離心20 min，取尿液上清液，置于EP管中，于-80℃下保存;代謝組學分析樣本取原尿液，在上述條件下離心后，采用0.22 μm微孔濾膜濾過，以續濾液作為代謝物分析供試品溶液。

1.4 APP/PS1雙轉基因小鼠Morris水迷宮測試

末次給藥后連續4 d給予相關訓練，其后APP/PS1雙轉基因小鼠進行空間學習能力測試，具體分為兩部分測試：首先進行空間定位航行實驗，所有組小鼠均測試3次，取均值。將Morris水迷宮均分為4個象限，每個象限的坐標貼上標識。將APP/PS1雙轉基因小鼠沿象限標識放入水中，并開始計時，直至小鼠爬上水中平臺，記錄逃避潛伏期時間。然后進行空間搜索實驗，撤去水下平臺，將小鼠在相同如水地點放入水中，記錄小鼠進入放置平臺的所在象限消耗時間和進入該象限的次數。

1.5 代謝組學分析條件

色譜柱：Hypersil ODS C18（30 mm×4.6 mm，3 μm）（美國Thermo Fisher Scientific公司）;乙腈溶液作為流動相A，0.1%甲酸-水溶液作為流動相B;柱溫31℃;流速為0.4 mL/min;進樣量為4 μL;梯度洗脫方法見表1。

電噴霧離子源：采用Q-ExactiveTM質譜分析系統（高分辨四級桿串聯軌道阱質譜儀）;脫溶劑氣流量：800 L/h;脫溶劑氣溫度：300℃;錐孔反吹氣流量：60 L/h;離子源溫度：150℃;錐孔電壓：35 V;毛細管電壓：3.0 kV。

1.6 數據處理

代謝數據采用熱電公司XCMS-Online分析軟件對原始數據進行數據預處理，然后采用SIMCA 11.5（瑞典Umetrics公司）軟件對代謝矩陣數據進行化學計量學分析，通過降維處理篩選組間差異貢獻大的離子作為潛在生物標記物，結合VIP大于1和HMDB中收錄的代謝物進行比對。

1.7 統計學方法

采用SPSS 17.0統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Morris水迷宮

2.1.1 三組小鼠定位航行能力? 小鼠定位航行能力采用逃避潛伏期進行表示。隨著訓練時的延長，各組小鼠的逃避潛伏期縮短，小鼠的學習能力提高。補陽還五湯組小鼠第4天的逃避潛伏期較模型組同期低，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。與空白組比較，模型組小鼠的逃避潛伏期明顯増加（P < 0.05或P < 0.01），提示模型小鼠出現顯著學習障礙。與模型組比較，補陽還五湯組小鼠逃避潛伏期顯著下降約45.85%，提示補陽還五湯能夠在一定程度上改善AD小鼠學習能力。見表2。

2.1.2 三組小鼠空間探索能力? 阿爾茨海默病小鼠的空間探索能力用穿越平臺次數和靶象限停留時間表示。與空白組比較，模型組小鼠的穿越平臺次數和靶象限停留時間明顯減少（P < 0.01），提示模型組小鼠存在學習記憶障礙。與模型組比較，補陽還五湯組平臺穿越次數和靶象限停留時間明顯增加（P < 0.01），提示補陽還五湯能夠一定程度地改善阿爾茨海默病小鼠學習記憶能力。見表2。

2.2 代謝組學研究

本部分基于高分辨質譜技術對阿爾茨海默病小鼠模型尿液進行信息采集，進行數據預處理。最終帶入Simcap 11.5進行模式識別分析。空白組和模型組兩組組內代謝聚集明顯，組間分離顯著，補陽還五湯組則處于兩組間，補陽還五湯組部分分布與空白組重合，提示補陽還五湯組整體代謝向健康狀態發展，補陽還五湯對阿爾茨海默病小鼠有良好的干預作用。通過OPLS-DA篩選生物標記物。結合數據庫共鑒定出潛在生物標記物4個（如表4），代謝通路富集分析，神經胺鑒定過程以神經胺為例。

4 討論

花生四烯酸代謝是炎性反應代謝的重要組成部分。其在炎炎性反應過程中發揮重要作用。本研究監測到花生四烯酸代謝途徑中花生四烯酸水平都有所升高。在氧化應激作用下，存在磷脂酶A2（sPLA2）的激活，激活的sPLA：通過增強蛋白激酶C（PKC）和細胞外調節蛋白激酶（ERK）的活性，進而增加胞質型磷脂酶A2（cPLA2）的激活，促進花生四烯酸釋放。它們水平的升高加重了氧化應激反應，進而加劇阿爾茨海默病的發展。

神經鞘脂類成分是構成神經組織的主要脂類。是胚胎發育階段神經系統和血管系統形成的重要原料，具有神經細胞保護作用[11-14]。本研究發現阿爾茨海默病小鼠血液中神經胺含量降低，可能與阿爾茨海默病發展密切相關。細胞膜破裂是阿爾茨海默病最顯著的特性退化之一，與膜脂質代謝異常有關。阿爾茨海默病患者腦內存在豐富的被激活的小膠質細胞，其作為中樞神經系統內的免疫細胞，激活可產生補體蛋白、炎癥因子等神經毒性物質，從而激活免疫炎性反應產生神經毒性。

脂肪酸細胞結構、能源存儲和信號轉導的生物活性分子，神經元中占有非常高的水平（50%的神經元細胞膜是由多不飽和脂肪酸構成）。有研究[15-20]表明，高水平的自由脂肪酸導致大鼠β-淀粉樣蛋白沉積和tau蛋白過度磷酸化，與阿爾茨海默病病程緊密相關。

本研究采用目前公認的APP/PS1雙轉基因小鼠作為阿爾茨海默病最佳動物模型，并基于高通量代謝組學技術對健康、疾病及給藥的不同狀態下小鼠尿液進行分析;通過模式識別和比對多元質譜庫信息進行代謝物的鑒定，最終獲得與阿爾茨海默病密切相關的生物學信息。給予補陽還五湯后，這些通路得到一定程度的抑制，推斷得到的生物標志物代謝是補陽還五湯治療阿爾茨海默病的潛在作用靶點。借助代謝組學技術，對補陽還五湯防治阿爾茨海默病的轉基因小鼠血漿代謝組進行輪廓表征和模式識別分析，發現補陽還五湯的早期干預能明顯影響阿爾茨海默病模型大鼠的代謝網絡，初步判定了4個阿爾茨海默病生物標記物;通過追蹤關鍵代謝產物相關聯的代謝通路的變化規律，發現補陽還五湯影響的主要代謝經路包括脂類代謝、脂肪酸代謝等。

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（收稿日期：2018-10-06? 本文編輯：王? ?蕾）