轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉卡那霉素和PCR檢測研究

[摘 要] 本文通過對30個陸地棉品系的卡那霉素檢測，最終發(fā)現(xiàn)有18個品系為非轉(zhuǎn)基因棉，2個品系為轉(zhuǎn)基因棉，10個品系是混合材料。混合材料分別為品系6、9、16、19、21、24、25、27、29和30。再經(jīng)過PCR驗證，混合材料中品系25、27為非轉(zhuǎn)基因棉花，其他品系為轉(zhuǎn)基因Bt棉，其中品系6、19、29植株體內(nèi)轉(zhuǎn)入的基因是Cry1A（b）基因。

[關(guān)鍵詞] 陸地棉品系;卡那霉素;PCR檢測

[中圖分類號] S562 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-7909（2019）02-101-3

在棉花育種中，轉(zhuǎn)基因植株的鑒定和篩選具有至關(guān)重要的作用。通過常規(guī)育種雜交獲得一批棉花植株后，通常要對其后代進行基因純合和遺傳穩(wěn)定性的研究、農(nóng)藝和經(jīng)濟性狀的篩選，甚至還要進行基因的轉(zhuǎn)育、產(chǎn)業(yè)化過程中的種性保持等一系列工作。卡那霉素處理棉花葉片篩選轉(zhuǎn)基因植株從理論上講是可行的。但在試驗過程中發(fā)現(xiàn)，影響卡那霉素處理效果的因素有很多，首先棉花葉片對卡那霉素存在一定的抗性，不同部位葉片的抗性水平表現(xiàn)了顯著差異，葉齡愈小的葉片對卡那霉素處理的反應(yīng)愈敏感，其與葉片的生長速率表現(xiàn)出了明顯的相關(guān)性。但不同的生育期，棉花葉片對卡那霉素抗性也表現(xiàn)了很大的差異[1]。隨著生育期的延長，植株對卡那霉素的抗性逐漸加強。因此，通過卡那霉素檢測的不一定就是非轉(zhuǎn)基因棉花，單純的卡那霉素檢測存在局限性。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）為轉(zhuǎn)基因植物的篩選提供了一種簡便、快速的方法[2]。PCR技術(shù)只需設(shè)計一對特異引物，提取組織DNA，并以此為模板進行PCR擴增特異性條帶即可[3]。Southern雜交、Nouthern雜交、Westhern雜交分別從整合、轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上檢測外源基因的說服力強，但技術(shù)要求高、操作煩瑣、費用大，不利于大批量檢測樣品。而PCR檢測技術(shù)能有效克服這些不足，且檢測靈敏度高、迅速，所需樣品量少，檢測不受時間、取樣部位限制，是一種應(yīng)用前景極廣的轉(zhuǎn)基因植物檢測方法。將卡那霉素檢測與PCR技術(shù)結(jié)合使用，能準(zhǔn)確地檢測大批量的轉(zhuǎn)基因棉花品系，在棉花育種上能廣泛使用且可有效節(jié)省成本。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑來源

供試棉花為第一師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所2號實驗地陸地棉育種品系材料，共30個，每個品系材料行長5 m，重復(fù)3次，編號為1～30，由第一師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所提供。DNA marker 1、6×loading-buffer、dNTP Mixture、Taq DNA Polymerase和Taq PCR Mastermix均為天根生物科技公司產(chǎn)品，瓊脂為Sigma公司產(chǎn)品，其他試劑購自天根生物科技公司，PCR引物由上海生工公司合成。

1.2 試驗方法

1.2.1 卡那霉素涂抹葉片試驗。用3 000 mg/L卡那霉素涂抹棉株植株的頂部葉片，7 d后觀察葉片對卡那霉素的反應(yīng)。葉色正常的為抗卡那霉素植株，為轉(zhuǎn)基因棉花;葉色變黃的為卡那霉素敏感植株，為非轉(zhuǎn)基因棉花。

1.2.2 PCR檢測。根據(jù)農(nóng)業(yè)部1485號公告《轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測抗蟲轉(zhuǎn)Bt基因棉花定性PCR方法》[4]進行。

一是DNA提取。稱取3 g新鮮葉片于研缽中，加液氮并迅速研磨成粉，轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管，并加入800 μL已預(yù)熱的CTAB裂解液（65 ℃），混勻后置于65 ℃水浴30 min，并且每10 min緩慢顛倒混勻一次。水浴后取出離心管，加入800 μL氯仿∶異戊醇（24∶1），反復(fù)顛倒多次，直至不分層為止，12 000 rpm離心10 min，用帶無尖的槍頭吸取上清并轉(zhuǎn)移至另一個2 mL的離心管中。加入等體積的預(yù)冷異丙醇，顛倒多次，直至有絮狀白色物質(zhì)生成，靜置30 min，用小槍頭吸取下層液體至1.5 mL離心管中，加入70%乙醇洗2次，無水乙醇洗1次，置超凈工作臺干燥2 h，加無菌水溶解DNA，4 ℃保存待用。

二是PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)在Gene AMP 240 PCR儀上進行，25.0 μL PCR反應(yīng)液中含Taq酶0.5 μL、dNTP 2.0 μL、上下引物各1.0 μL、buffer 2.0 μL，DNA模板1.0 μL以及ddH2O 18.5 μL。采用變性溫度94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 30 s，T=50～65 ℃，72 ℃ 30 s，并在此退火溫度下進行30次循環(huán)，最后72 ℃延伸4 min。Sad1基因Sadl-F：5‘一CCAAAGGAGGTGCCTGTTCA-3'，Sadl-R：5‘-TTGAGGTGAGTCAGAATGTTGTTC-3’，預(yù)期片段大小為107 bp。Bt基因特異性序列Bt-F：5‘-GAAGGTTTGAGCAATCTCTAC-3’，Bt-R：5‘-CGATCAGCCTAGTAAGGTCGT-3’，預(yù)期擴增片段大小為301 bp。Bt基因特異性序列Cry1A（b）-F：5‘-CTGGTGGACATCATCTGGGGCATCTTCG-3’，Cry1A（b）-R：5‘-TTGGTA-3'，預(yù)期擴增片段大小為142 bp，Maker為M1061。

三是電泳。采用0.8%瓊脂糖凝膠平板電泳，UVP成像系統(tǒng)照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 棉花卡那霉素檢測

棉葉經(jīng)卡那霉素處理7 d后，一部分棉苗葉片處理部位葉色正常（標(biāo)記為卡檢陽性）為綠色，而另一部分棉苗葉片處理部位褪綠、變黃（標(biāo)記為卡檢陰性），如圖1所示。葉片上的反應(yīng)一致，因此可以排除其他干擾（機械損傷、病蟲害等）的可能性，處理結(jié)果真實可靠[5-6]。

如表1所示，經(jīng)卡那霉素檢測，陸地棉30個品系中，共有18個品系可以確定為陰性，無Bt基因轉(zhuǎn)入，為非轉(zhuǎn)基因棉;2個品系為轉(zhuǎn)基因品系，為品系13、28;10個品系為混合材料（品系6、9、16、19、21、24、25、27、29和30），不能確定是否為轉(zhuǎn)基因棉，需要進一步驗證。

2.2 PCR檢測

2.2.1 內(nèi)標(biāo)基因Sad1的PCR擴增。經(jīng)過內(nèi)標(biāo)基因Sad1的PCR擴增，泳道3、11的DNA模板分別為品系25、27，無PCR產(chǎn)物產(chǎn)生，說明品系25、27為非轉(zhuǎn)基因棉花;品系9、16、19、21、24、29、30和6作為模板，有PCR產(chǎn)物產(chǎn)生，說明其為轉(zhuǎn)基因棉花，如圖2所示。

2.2.2 Bt基因的PCR擴增。經(jīng)過Bt基因的PCR擴增，泳道5、9表現(xiàn)為陰性，無PCR產(chǎn)物，DNA模板分別為品系9、24，表明植株中所轉(zhuǎn)的基因為非Bt基因;泳道3、4、6、7、8和10表現(xiàn)為陽性，DNA模板分別為品系6、16、19、21、29和30，表明品系6、16、19、21、29和30所轉(zhuǎn)的基因均為Bt基因，如圖3所示。

2.2.3 Cry1A（b）基因的PCR擴增。經(jīng)過Cry1A（b）基因的PCR擴增，泳道5、6、7對應(yīng)的DNA模板為品系16、21、30，均為陰性，無PCR產(chǎn)物，表示植株體內(nèi)無Cry1A（b）基因的轉(zhuǎn)入，轉(zhuǎn)入的基因可能為其他基因，也有可能為Bt基因的其他類型。泳道2、3、4有PCR產(chǎn)物，DNA模板分別為品系6、19和29，表示植株體內(nèi)轉(zhuǎn)入的基因是Cry1A（b）基因，如圖4所示。

3 討論

3.1 棉花對卡那霉素的抗性

研究表明，棉花對卡那霉素具有一定的抗性，其抗性大小主要與葉齡和棉株生育時期有關(guān)。葉齡越小，其抗性越低，表現(xiàn)在對低濃度卡那霉素（<500 mg/L）敏感，葉片褪綠速度快（<3 d）[7];生育期越后，其抗性越強，蕾期棉花在5 000 mg/L卡那霉素處理下5 d不出現(xiàn)明顯變化。真葉較子葉敏感，老化的葉片對卡那霉素則變得極不敏感，新展開的葉片對卡那霉素較敏感，越老的葉片對其抗性越強[1]。為了不給檢測工作帶來誤差，選擇棉花生長至四葉一心或五葉一心時期，選取最頂端的葉片涂抹為最佳。棉花蕾期雖然對卡那霉素極為敏感，但是正值棉花結(jié)鈴時期，如果卡那霉素的濃度掌握不好，極易引起棉葉所涂部位變褐壞死，影響植株的光合作用，進一步影響棉花的座鈴率。打頂之后，植株高大易于涂抹，但葉片已老化抗性增強。

本試驗研究表明通過卡那霉素檢測和PCR技術(shù)結(jié)合能有效快速地檢測轉(zhuǎn)基因棉花，節(jié)省人力物力，適用于面積大、批量大的棉田試驗[8]。

3.2 陸地棉品系分析

本試驗研究的30個品系遺傳背景多樣，其父本母本可能攜帶外源基因，也可能經(jīng)過原始材料中轉(zhuǎn)基因植株花粉的擴散，經(jīng)過幾代的性狀分離，后代材料有可能含有外源基因片段，甚至同一品系部分植株也有可能存在外源基因，這就需要育種專家繼續(xù)通過選單株提高品系的純度和質(zhì)量。

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