慢性乙型肝炎肝衰竭患者外周血Th22細胞和IL-22的變化

陳敏，張宏宇，朱珉之，申紅玉，劉小琴，*

（常州市第三人民醫(yī)院，1.檢驗科，2.肝病研究所，江蘇 常州213003）

我國是乙型肝炎病毒（HBV）感染大國，HBV感染是肝衰竭發(fā)生的主要原因之一。病理學檢查雖為診斷肝衰竭的金標準，但考慮到肝衰竭患者病情嚴重，常有凝血功能障礙，很難耐受肝臟穿刺等有創(chuàng)操作。目前臨床上，ALT、AST、總膽紅素和凝血酶原活性（prothrombin activity，PTA）可作為肝臟炎癥及損傷的評價指標，但特異性均不強，在重癥患者中容易出現“膽酶分離”現象。終末期肝病模型（model for end-stage liver disease，MELD）各種評分系統被用于評估肝衰竭患者的病情嚴重程度和疾病預后，但計算較為繁瑣。因此，尋找新的標志物用于肝衰竭患者的早期診斷及病情評估具有一定意義。

輔助性T細胞在慢性HBV感染所致的肝功能損傷及肝衰竭過程中發(fā)揮重要作用，我們的前期研究顯示，Th17細胞及相關因子參與慢性HBV感染進程［1］。Th22細胞是一種新發(fā)現的輔助性T細胞，多項研究［2-6］表明，Th22細胞及IL-22與多種肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關。因此，本研究主要觀察Th22細胞及其相關因子在HBV感染肝衰竭患者外周血中的變化，初步評價其在肝衰竭患者中的臨床應用價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象

收集我院2015年6月至2016年2月住院的慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者20例（CHB組），其中男14例，女6例，平均年齡（48.4±11.2）歲；HBV相關肝衰竭患者20例（肝衰竭組），其中男15例，女5例，平均年齡（50.2±12.5）歲。另以體檢健康者20例作為對照組，其中男15例，女5例，平均年齡（48.5±11.6）歲。CHB患者診斷標準符合2015年中華醫(yī)學會肝病學分會和中華醫(yī)學會感染學分會聯合修訂的《慢性乙型肝炎防治指南》［7］；HBV相關肝衰竭患者診斷標準符合2012年中華醫(yī)學會感染學分會肝衰竭與人工肝學組和中華醫(yī)學會肝病學分會重型肝病與人工肝學組聯合制定的《肝衰竭診治指南》［8］。所有病例入組前3個月，均未使用過免疫調節(jié)類藥物，無合并HCV、丁型肝炎病毒、庚型肝炎病毒、HIV感染和自身免疫性肝病，無原發(fā)性肝癌及肝臟轉移性腫瘤。所有患者在入院初采集血液標本進行相關檢測。

1.2 流式細胞術檢測Th22細胞

采集肝素抗凝血5 mL，用淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞（PBMC），調整PBMC懸液細胞密度至5×106／mL，取100μL細胞懸液，加入等體積RPMI-1640稀釋，應用佛波酯和離子霉素（美國eBioscience公司）聯合刺激后，加入1μL布雷菲德菌素A（BD公司），37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。取上述標本，加入FITC標記的CD4抗體（BD公司），充分混勻，4℃，避光30 min。加入100μL固定劑（BD公司）并孵育15 min；加入2 mL PBS，1 500 r／min離心5 min，傾去上清液，振蕩重懸細胞；加入100μL破膜劑（BD公司）和10μL IL-17AAPC抗體（eBioscience公司）、10μL IFN-γ-PE抗體（eBioscience公司）和20μL IL-22-PerCP抗體（eBioscience公司），振蕩混勻后孵育20 min；加入2 mL PBS洗滌，1 500 r／min離心5 min，去上清液；加入300μL PBS重懸細胞，應用BD公司FACSC流式細胞儀進行Th22細胞檢測。根據前向角FSC和側向角SSC參數圈定淋巴細胞，再用CD4-FITC和IFN-γ-PE分出P1群（IFN-γ-CD4+）細胞，再從P1群細胞中分離出Th22（IFN-γ-IL-17-IL-22+CD4+）細胞。

1.3 ELISA法檢測血漿IL-22濃度

應用雙抗體夾心ELISA法檢測血漿IL-22濃度（ELISA試劑盒為美國eBioscience公司產品），以標準品濃度為橫坐標，D值為縱坐標，計算出標準曲線的回歸方程，將樣本的D值帶入方程式，計算出樣本濃度。具體操作按試劑盒操作說明進行。

1.4 其他指標檢測

ALT、總膽紅素、HBV-DNA均為實驗室常規(guī)開展項目。

1.5 統計學分析

采用SPSS 17.0軟件包進行統計學分析。實驗數據經K-S檢驗呈正態(tài)分布，以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；連續(xù)變量相關性分析采用Pearson或Spearman相關分析；繪制受試者工作特征（receive operating characteristic，ROC）曲線并計算診斷敏感性和特異性。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組一般資料及實驗室指標比較

3組性別和年齡間的差異均無統計學意義（均P＞0.05）；肝衰竭組HBV-DNA水平雖高于CHB組，但差異無統計學意義（P＞0.05）；肝衰竭組和CHB組ALT和總膽紅素水平均明顯高于對照組（均P＜0.01）；肝衰竭組總膽紅素濃度顯著高于CHB組（P＜0.01）。見表1。

表1 各組一般資料及實驗室指標的比較 n＝20，±s

表1 各組一般資料及實驗室指標的比較 n＝20，±s

a：P＜0.01，與對照組比較；b：P＜0.01，與CHB組比較

組別 男／女（例） 年齡（歲） HBV-DNA（lg拷貝／mL） ALT（U／L） 總膽紅素（μmol／L）肝衰竭組 15／5 50.2±12.5 5.26±1.34 210.40±144.60a 309.10±161.54a，b CHB組 14／6 48.4±11.2 5.03±1.22 180.65±124.69a 31.55±12.78a對照組 15／5 48.5±11.6 19.75±5.45 10.2±3.37檢驗值 χ2＝0.17 F＝0.156 t＝0.554 F＝17.30 F＝63.51 P值0.918 0.856 0.582 0.000 0.000

2.2 3組患者外周血Th22細胞頻數和IL-22濃度比較

流式細胞術檢測結果顯示，肝衰竭組Th22細胞頻數明顯高于CHB組及對照組（P ＝0.048，0.001）；CHB組Th22細胞頻數雖高于對照組，但差異無統計學意義（P＝0.193）。見表2、圖1。ELISA法檢測結果顯示，肝衰竭患者IL-22濃度顯著高于CHB組和對照組（P＝0.013，0.000）；CHB組IL-22濃度雖高于對照組，但差異無統計學意義（P＝0.075）。見表2。

表2 各組患者外周血Th22細胞頻數及IL-22濃度比較n＝20

圖1 流式細胞術檢測3組患者外周血Th22細胞頻數

2.3 不同分期肝衰竭患者外周血Th22細胞和IL-22濃度差異

將肝衰竭患者分為早期（30%＜PTA≤40%）、中期（20%＜PTA≤30%）和晚期（PTA≤20%）3組。早期和中期肝衰竭患者Th22細胞頻數和IL-22濃度雖高于晚期患者，但差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 不同分期肝衰竭患者外周血Th22細胞頻數及IL-22濃度比較

2.4 外周血Th22細胞及IL-22預測肝衰竭發(fā)生的ROC曲線分析

將肝衰竭組和CHB組患者Th22細胞頻數及IL-22濃度等數據繪制ROC曲線，見圖2。Th22細胞在CHB患者中預測肝衰竭發(fā)生的ROC曲線下面積為0.655（95% CI：0.484～0.826），雖高于0.5，但差異無統計學意義（P＝0.094）；IL-22預測肝衰竭發(fā)生的ROC曲線下面積為0.753（95% CI：0.598～0.907），顯著高于0.5，差異有統計學意義（P＝0.006）。IL-22預測肝衰竭最佳臨界值為32.80 pg／mL，此時的敏感性為80.0%，特異性為65.0%，陽性預測值為69.57%，陰性預測值為76.47%，約登指數為0.725。

圖2 Th22細胞和IL-22預測肝衰竭發(fā)生的ROC曲線

2.5 肝衰竭患者Th22細胞及IL-22與肝功能、HBV病毒載量的關系

Pearson相關分析結果顯示，肝衰竭患者外周血Th22細胞頻數與IL-22濃度呈正相關（r＝0.766，P＜0.01）。Pearson或Spearman相關分析結果顯示，肝衰竭患者外周血Th22細胞頻數、IL-22濃度與ALT表達水平不相關（均P＞0.05），與lg HBV-DNA水平也不相關（均P＞0.05），與總膽紅素濃度呈正相關（r＝0.420，0.476，均P＜0.05）。

3 討論

Th22細胞為新近發(fā)現的一種CD4+Th亞群，分泌IL-22和TNF-α，但不分泌IFN-γ和IL-17，具有表型CCR4+、CCR6+、CCR10+的特點，其關鍵轉錄因子為芳香烴受體。IL-22主要來源于Th22細胞，Th1和Th17細胞也可少量分泌IL-22。IL-22受體包含一個IL-22R1鏈和一個IL-10R2鏈，IL-22結合的特異性依賴于IL-22R1，而IL-10R2則介導細胞內的信號轉導。IL-22R1表達于肝臟、皮膚、肺、腎臟、胰腺等組織，T細胞、B細胞、NK細胞及單核細胞等免疫細胞缺少IL-22R1的表達。因此，Th22作用特點有別于其他淋巴細胞，其作用對象非免疫細胞，而是肝臟、皮膚等表達IL-22R1的組織細胞［9］。

既往研究表明，Th22細胞在自身免疫性疾病及腫瘤中發(fā)揮重要作用［10-11］，表明Th22可能參與機體的免疫應答及炎癥反應，而在CHB活動期常伴有免疫系統的激活和肝組織炎癥損傷。目前認為，IL-22在HBV感染的肝臟疾病中是一把雙刃劍，既有促炎作用，也有保護肝臟作用，究竟發(fā)揮什么作用，可能依賴于肝臟特異性的微環(huán)境。在急性HBV感染時，IL-22可能發(fā)揮促炎作用，幫助機體清除HBV，但同時也會引起肝細胞損傷；在HBV慢性感染進程中，IL-22可能發(fā)揮保護作用，即促進肝細胞分化和生存來補償長期慢性炎癥引起的肝損傷［12］。

本研究結果顯示，CHB肝衰竭患者外周血Th22細胞頻數和IL-22濃度高于健康對照組，與其他研究報道一致［4-6］，提示Th22細胞和IL-22可能在肝衰竭進展中發(fā)揮一定作用。已有研究表明，IL-22通過活化下游通路信號分子及STAT3，在ConA誘導的肝損傷小鼠模型中發(fā)揮保護作用［13］。慢性HBV感染進程中，由炎癥細胞生成的IL-22可通過STAT3信號通路促進肝祖細胞增殖［14］。Xing等［15］研究發(fā)現，在GaIN／LPS誘導的急性肝衰竭小鼠模型中，應用rhIL-22治療后，小鼠ALT、總膽紅素降低，死亡率顯著下降；進一步研究發(fā)現rhIL-22治療可增加肝臟還原型谷胱甘肽水平，降低丙二醛含量，降低血清TNF-α和肝臟Caspase-3的活性，rhIL-22可通過激活STAT3上調Bcl-xL，HO-1和Ref-1因子的表達，提示IL-22在GaIN／LPS誘導的肝損傷中可通過抗凋亡、抗氧化和抗炎癥等方式發(fā)揮保護作用。因此，我們推測慢性HBV肝衰竭患者中Th22和IL-22主要是代償性增高，以減少肝臟損傷程度。

由于本研究樣本量較小，肝衰竭早期和中期患者外周血Th22細胞頻數和IL-22濃度雖高于晚期患者，但差異無統計學意義。隨著肝衰竭的進展，Th22細胞和IL-22呈下降趨勢，我們推測，可能與機體代償能力有關。CHB至肝衰竭早期這個過程中，機體及肝臟具有一定的代償能力，損傷及炎癥反應可刺激Th22細胞和IL-22的產生并發(fā)揮保護作用。而到了肝衰竭中晚期，隨著肝硬化、腹腔積液、肝性腦病等癥狀的出現，機體免疫功能及代償能力都會有所下降，當損傷和炎癥反應刺激時，Th22細胞和IL-22釋放減少，其水平比正常人還低。

ROC曲線分析顯示，Th22細胞在CHB患者中預測肝衰竭中的價值有限，而IL-22曲線下面積達到0.753（95% CI：0.598～0.907），提示IL-22可作為CHB預測肝衰竭發(fā)生的一個較好指標。相關性分析結果顯示，肝衰竭患者外周血Th22細胞頻數、IL-22濃度和病毒復制指標HBV-DNA無相關性。Zhang等［16］研究發(fā)現，對HBV轉基因小鼠注射單劑量的IL-22，將使得肝臟促炎基因表達增加，但病毒表達水平無變化，提示IL-22不直接抑制HBV病毒的復制，這也可以解釋CHB肝衰竭患者Th22細胞頻數和IL-22濃度與HBV-DNA無相關性。本研究結果顯示Th22細胞頻數和IL-22濃度在肝衰竭患者中與ALT水平不相關，但與總膽紅素呈正相關。由于IL-22在肝細胞損傷時代償性增高，因此IL-22與肝臟損傷程度指標總膽紅素呈正相關，而與ALT不相關主要考慮可能是肝衰竭患者ALT水平與肝臟炎癥及損傷并不一定相關。

綜上所述，Th22細胞及相關因子IL-22在CHB肝衰竭患者中異常表達，可能參與了肝衰竭的發(fā)病機制。IL-22可作為CHB患者肝衰竭發(fā)生的一個預測指標。監(jiān)測肝衰竭患者外周血Th22細胞頻數和IL-22濃度對肝臟損傷程度的判斷具有一定意義。今后我們將進一步擴大樣本量，動態(tài)觀察治療前后Th22細胞和IL-22的變化，評價其在疾病療效及預后中的價值。