丁酸鈉聯合Feed促進293F細胞表達PD-1嵌合抗體

黃子逸，陳晨，彭雪楠，申春蘋，朱一蓓，王雪峰，張學光

（1.蘇州大學附屬第一醫院江蘇省臨床免疫研究所，江蘇 蘇州215006；2.江蘇省臨床免疫學重點實驗室，江蘇 蘇州215006；3.江蘇省胃腸道腫瘤免疫重點實驗室，江蘇 蘇州215006；4.蘇州大學基礎醫學與生物科學學院生物化學與分子生物學系，江蘇 蘇州215123；5.蘇州大學基礎醫學與生物科學學院免疫學系，江蘇 蘇州215123）

最近程序性死亡受體-1（programmed death-1，PD-1）免疫卡控點治療性抗體帶來了前所未有的臨床效益［1］，但作為臨床抗腫瘤藥物，PD-1抗體須通過體外無血清培養進行制備，并避免動物來源成分和內毒素污染。在基因工程抗體的生產制備過程中，增加抗體表達可以降低治療性抗體的生產成本［2］。293F細胞具有較強的蛋白質表達加工能力，因此常用于表達外源重組蛋白［3］。研究表明，添加小分子短鏈脂肪酸丁酸鈉是一種提高真核細胞蛋白產量經濟有效的方法［4］。丁酸鈉可增加真核細胞中凝血因子、組織纖溶酶原激活物、促紅細胞生成素等各種蛋白的表達［5-7］，增加程度取決于蛋白產物種類。另有研究表明，丁酸鈉可一定程度抑制細胞生長、阻斷細胞周期并誘導細胞凋亡［8］。因此，單獨使用丁酸鈉易致細胞凋亡和改變N-糖基化相關基因表達［9-11］，對細胞生長和蛋白產量產生不利影響。

CHO CD Efficient Feed（以下簡稱Feed）補充劑可為細胞培養提供增強代謝的營養元素，與常規培養條件相比，添加Feed的細胞生長和蛋白產量顯著增加。細胞擴增期間，隨著營養物質耗盡，積累的細胞代謝物對細胞產生毒性作用，培養環境滲透壓升高［12］。Feed可補充細胞增殖過程中培養基所消耗的成分而不額外增加鹽離子或未消耗的氨基酸等，充分保護細胞免受自由基和細胞凋亡引起的損傷。

PD-1（CD279）作為免疫卡控點受體分子［13］，與腫瘤的發生、發展密切相關。阻斷PD-1／PD-L1信號可增強腫瘤和病毒特異性CD8+T細胞的活性，從而增強淋巴細胞對腫瘤和病毒的殺傷能力［14-15］。目前，抗人PD-1單克隆抗體作為腫瘤免疫治療的有效靶分子已在臨床治療中取得顯著成效［16］。基于我們前期自主研制的抗人PD-1嵌合抗體，瞬時轉染獲得表達抗人PD-1基因工程抗體的293F細胞，本研究旨在用不同濃度的丁酸鈉配合Feed處理293F細胞，觀察和比較不同培養條件對細胞生長代謝和表達PD-1抗體的影響；并在細胞培養期間檢測細胞周期，測定單抗表達量，以達到抗體產量的最大化。

1 材料和方法

1.1 293F細胞傳代培養

取1 L不含L-谷氨酰胺的Hyclone SFM4 Transfx-293培養基，加入10 mL L-谷氨酰胺（200 mmol／L）。將細胞用新鮮配制的Hyclone培養基懸浮在三角搖瓶（Thermo Fisher公司）中，于37℃，8%CO2和一定濕度的培養箱進行傳代培養。

1.2 293F細胞的培養

在轉染前1天將培養基更換成Gibco?Free-StyleTM293表達培養基。傳代前細胞計數保持在1.5×106／mL。收集細胞并將細胞懸液轉移到離心管中，以600×g常溫離心5 min；棄上清液，并用新鮮的FreeStyleTM293培養基重懸。

1.3 轉染試劑聚乙烯亞胺（polyethyleneimine，PEI）的制備

稱取100 mg PEI溶于95 mL Milli-Q水中，逐滴加入濃HCl直至溶液pH＝2.0，磁力攪拌直至PEI溶解；緩慢滴加5 mol／L NaOH溶液將pH調至7.2；繼續加Milli-Q水直至PEI終體積為100 mL，0.2 μm膜過濾滅菌。

1.4 丁酸鈉溶液的制備

PBS溶解丁酸鈉粉劑（Sigma公司），制備1 mol／L的儲備溶液，并用0.2μm膜過濾滅菌，-20℃儲存。

1.5 瞬時轉染293F細胞的培養

取2×106／mL細胞接種于50 mL flask瓶中，分為A，B組，每組分別加入濃度梯度丁酸鈉，即0，0.5，1.0，2.0，4.0 mmol／L，分別記為A1～A5，B1～B5；A組細胞培養過程中于第1，3，5天額外添加5%Feed添加劑（美國Gibco公司），B組則不加。每24 h計數細胞并收集一定量的細胞樣本檢測細胞周期。

1.6 培養過程中293F活細胞密度的測定

根據本實驗的檢測要求，利用Countsar全自動細胞計數儀，每日取樣進行細胞精確計數，獲得細胞活率、細胞平均直徑、細胞平均圓度等測量結果，觀察細胞結團情況。

1.7 抗人PD-1嵌合單抗的表達及定量

本所自行研制分泌抗人PD-1單抗的雜交瘤細胞株，收集細胞提取cDNA；利用特定設計的上、下游引物，PCR克隆該雜交瘤細胞重鏈可變區和輕鏈可變區；重、輕鏈可變區PCR產物與酶切預先處理的線性表達載體連接，轉化感受態大腸埃希菌；測序并挑選轉化菌，擴大培養后抽提質粒；單抗重鏈和輕鏈可變區的表達載體共轉染真核細胞株293F細胞；連續培養7 d，4 000×g常溫離心30 min；取含有目的抗體的上清液，流式細胞術檢測表達單抗與L929／PD-1轉基因細胞結合良好，陽性率為95%以上。

收獲培養上清液，過Protein A親和層析柱，用100 mmol／L的甘氮酸（pH＝2.6）洗脫；預先加入1 mol／L Tris緩沖液（pH＝9）于收集管中，中和洗脫樣品；將洗脫的抗體收集至離心管，4 000×g，4℃離心30 min。BCA蛋白定量試劑盒測定純化抗體濃度并電泳鑒定，根據抗體總量和表達體積計算產量（μg／mL）。

1.8 細胞周期檢測

細胞以500×g常溫離心5 min；預冷PBS洗2遍；細胞懸液500×g，4℃離心5 min；取細胞沉淀轉移至冰上，每管1×106個細胞重懸于PBS；逐滴緩慢加入預冷的無水乙醇至濃度為70%，4℃固定過夜；1 000×g，4℃離心5 min；棄上清液，將細胞重懸于1 mL PBS，500×g，4℃離心10 min；取細胞沉淀，重懸于500μL含50μg／mL的碘化吡啶和100μg／mL的RNA酶（Sigma公司）的PBS中，37℃避光孵育30 min；流式細胞儀檢測各組樣品的細胞周期。

1.9 流式細胞術鑒定抗人PD-1嵌合抗體

轉染后第7天收集培養物，4 000×g，4℃離心20 min；純化抗體稀釋一定倍數后，與L929／PD-1細胞于4℃反應40 min；PBS洗滌2次，加PE標記的羊抗人IgG，Fcγ鏈特異性反應二抗，4℃反應20 min；PBS洗2遍；細胞重懸于預冷的0.5 mL PBS，流式細胞術鑒定抗人PD-1嵌合抗體的表達水平與效價。

1.10 統計學方法

運用SPSS 20.0軟件進行統計分析，計量結果以均數±標準差（±s）表示，對各組數據進行t檢驗和方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 丁酸鈉和Feed影響293F細胞增殖與活細胞密度

A組中未加丁酸鈉處理的A1細胞第4天最大活細胞密度為7.66×106／mL，用0.5，1.0，2.0和4.0 mmol／L丁酸鈉處理的A2～A5細胞最大活細胞密度分別為5.80×106／mL，5.05×106／mL，5.21×106／mL，4.68×106／mL（圖1A）。相應地，B組未處理細胞B1第4天最大活細胞密度為5.38×106／mL，加入濃度梯度丁酸鈉的B2～B5細胞最大活細胞密度分別為4.37×106／mL，3.29×106／mL，3.76×106／mL，3.54×106／mL（圖1B）。同組內未用丁酸鈉處理的293F細胞最高活細胞數明顯多于丁酸鈉處理過的細胞；兩組間相比，添加Feed的A組細胞的增殖數量高于B組。

圖1 丁酸鈉和CHO CD Efficient Feed對293F活細胞密度的劑量效應

2.2 不同濃度丁酸鈉對細胞周期的影響

流式細胞術檢測結果顯示，丁酸鈉增加了G0／G1期細胞數量。未加丁酸鈉的A1細胞在第3天和第7天G1期占比為36.836%和34.913%，第3天A2～A5組G1期細胞均在60%左右，直至第7天培養結束，G1期細胞占比略有減少；較高濃度（2.0，4.0 mmol／L）的丁酸鈉促使更多數量的細胞位于G1期，減少S期細胞數（圖2）。

圖2 流式細胞儀檢測濃度梯度丁酸鈉作用的293F細胞周期

2.3 丁酸鈉與Feed聯合作用提高293F細胞的抗體產量

盡管用丁酸鈉處理后活細胞數量進一步下降，第7天收獲抗體檢測產量發現，1.0 mmol／L丁酸鈉+5% Feed培養的A3組細胞表達的PD-1單抗產量達到最高值57.4 mg／L，明顯高于A1、A2組（P均＜0.05）；進一步提高丁酸鈉濃度，抗體產量有所減少，2.0 mmol／L和4.0 mmol／L丁酸鈉作用下抗體產量為43.2 mg／L和32.7 mg／L；不加Feed的B組細胞抗體分泌量遠低于添加的A組，產量最高的A3組因補充了Feed，抗體表達量較未加Feed的B3組明顯增加（t＝7.1，P＜0.01）；其中B1組未加丁酸鈉和Feed，最終收獲PD-1抗體僅為7.1 mg／L，約是最高產量的1／8。見圖3。

2.4 丁酸鈉與Feed聯合應用對PD-1嵌合抗體識別抗原位點鑒定和抗體效價的影響

取A1～A5培養上清液，經純化獲得的PD-1嵌合抗體均能識別表達于轉基因細胞株L929／PD-1表面的PD-1分子；5組抗體稀釋一定倍數后，當濃度為0.5μg／mL時，不加丁酸鈉的A1組細胞表達的嵌合抗體與L929／PD-1結合的陽性率有所下降，低于其他4組；相同條件下A2～A5組細胞的結合率不變，仍然保持在90%以上（圖4）。由此表明，添加丁酸鈉對PD-1嵌合抗體的效價有一定的影響。

圖3 添加丁酸鈉和CHO CD Efficient Feed對293F細胞抗體產量的影響

圖4 流式細胞術檢測PD-1嵌合抗體特異性識別轉基因細胞L929/PD-1表面PD-1分子

3 討論

丁酸鈉是一種天然小分子，作用于細胞周期影響細胞生長和分化。研究發現，丁酸鈉，尤其是穩定存在于體內的另一種類似物三丁酸甘油酯，是DNA有效合成和細胞增殖的抑制劑［17］。在常規培養條件下，丁酸鈉可通過誘導G0／G1期阻滯和細胞凋亡從而抑制細胞生長與增殖［18］，其機制在于丁酸鈉可調節細胞周期蛋白的表達，如細胞周期蛋白依賴性激酶及其抑制劑，二者都是參與G1期細胞周期調控的重要蛋白［19］。研究證實，丁酸鹽下調小鼠成纖維細胞的細胞周期蛋白（cyclin）D1 mRNA和蛋白質的表達；對豬上皮細胞的作用則與cyclin D1相反，丁酸鈉增加cyclin D3蛋白的表達水平，隨著cyclin D3表達上調，cyclin D1表達降低，該現象與G0／G1期細胞周期阻滯密切相關［20］。上述研究表明，丁酸鈉誘導包括腫瘤細胞在內的大多數細胞系的G1期細胞周期阻滯；這種G1期阻滯效應表明，為了通過G1期進入DNA合成S期，細胞需要具備對丁酸鈉敏感的相關基因和蛋白質［21］。

本研究結果表明，盡管在常規細胞培養條件下加入丁酸鈉，可增加293F細胞PD-1單抗表達量，然而由于丁酸鈉對細胞生長和活性有抑制作用，與未處理的細胞相比，所有用丁酸鈉處理的活細胞數量均有所下降。因此，為了消除丁酸鈉帶來的不良反應，在培養過程中使用5%Feed補充培養基消耗；與未處理的細胞相比，抗體收獲量至少增加2倍。由此可見，Feed對293F細胞瞬時表達PD-1抗體是必不可少的補充劑，同時隨著丁酸鈉濃度進一步提高至2.0 mmol／L和4.0 mmol／L，293F細胞增殖受到抑制，PD-1抗體產量開始減少。Feed在無血清培養基的穩定性低于有血清培養基，利用丁酸鈉和Feed有利于細胞生長和蛋白產生的優勢，因此本研究在培養后第1天添加丁酸鈉，第1，3，5天補充Feed，觀察二者對抗體表達的聯合效應。丁酸鈉和Feed聯合培養的293F細胞抗體產量高于單獨使用丁酸鈉或Feed，且最佳濃度為加入1.0 mmol／L丁酸鈉和5% Feed，此時抗體產量最高。本研究可能對大規模工業生產治療性抗體藥物具有一定的參考價值。