桑黃多糖的體外抗氧化作用研究＊

崔詩遙，曾 鵬，郎明紫，解鴻青，陳亞潔，李聰慧，沈張飛，李有貴，時連根＊

（1.浙江大學 動物科學學院，浙江 杭州 310058； 2.浙江省農業科學院 蠶桑研究所，浙江 杭州 310021）

桑黃（Phellinus baumii）俗稱桑耳、桑寄生，是一種珍貴的藥用真菌，因寄生于桑樹而得名，有“森林黃金”之美稱。桑黃在我國作為名貴中藥材入藥已有2000多年歷史，遠在戰國時期的《神農本草經》中就有“桑黃久服輕身不老延年”的記載。桑黃味微苦，性寒，中醫認為其利五臟、軟堅、排毒、止血等，可用于治療血淋、血崩、脫肛瀉血、帶下、經閉、脾虛泄瀉等［1，2］。現代藥理學研究證實，桑黃含有多糖類、黃酮類、萜類等多種活性成分，臨床用于調節機體免疫、延緩衰老、抗腫瘤、保肝護肝、降血糖、抗炎癥等［3，4］。但桑黃的藥理作用機理沒有被很好研究，這阻礙了桑黃藥用水平提高與藥用范圍擴大。本文通過桑黃主要活性成分多糖的抗DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）自由基、抗羥基自由基（·OH）和還原力試驗，研究桑黃多糖的體外抗氧化作用。

1 材料與方法

1.1 供試桑黃及主要試劑和儀器

桑黃子實體由浙江省農業科學院蠶桑研究所提供，經干燥粉碎后過80目篩，于4℃存儲備用。

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）為Sigma公司產品；FeSO4、雙氧水（H2O2）、水楊酸、無水乙醇、維生素C、鐵氰化鉀、三氯乙酸、FeCl3等化學試劑均為分析純，購自中國醫藥上海化學試劑公司；D101大孔樹脂購自天津興南允能高分子技術有限公司。

UV-2550紫外可見分光光度計（日本島津公司）；CR22GⅢ高速冷凍離心機（日本日立公司）；YQ-1002C型超聲波清洗儀（上海易凈超聲波儀器有限公司）；RE52CS旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠產品）；QT-80FC自動部分收集器（上海琪特分析儀器廠）；free zone 6 plus冷凍干燥機（Labconco公司）。

1.2 桑黃多糖的提取與純化

提取采用超聲波輔助乙醇浸提法［5］。稱取桑黃子實體粉末，按照1∶26料液比（質量體積比，g/mL）加入雙重蒸餾水，混勻后，在30℃下用超聲波清洗儀以500 W功率53 KHz頻率的超聲波場作用30 min，然后于100℃水浴中回流提取3次，合計提取時間4.35 h，每次提取后進行抽濾處理，并將濾液于10000 rpm離心5 min，取上清液。合并3次上清液，用旋轉蒸發儀濃縮，得到桑黃多糖粗提液。

純化采用依次過DEAE離子交換柱、Sephacryl S400凝膠柱、Sephacryl S200凝膠柱的方法［6］。取桑黃多糖粗提液過0.45 mm濾膜，先上DEAE離子交換柱，用0.1 M NaCl液洗脫，再上Sephacryl S400凝膠柱，用蒸餾水洗脫，最后上Sephacryl S200凝膠柱，用蒸餾水洗脫，自動收集器收集多糖洗脫液，-50℃下真空干燥，得到純一桑黃多糖，用于體外抗氧化試驗。

1.3 抗DPPH自由基活性測定

參考Hsu等（2006）報道的方法［7］。取不同濃度桑黃多糖溶液（用蒸餾水配制）2 mL，加入等體積的0.04 mmol/L DPPH溶液（用95%乙醇配制），混勻后在室溫下避光反應30 min，3000 r/min離心10 min，取上清液在517 nm下測定吸光度，試驗重復三次，以維生素C為陽性對照，按下公式計算DPPH清除率：

DPPH清除率（%）=［A3-（A1-A2）］/A3×100%，式中A1為2 mL桑黃多糖+2 mL DPPH的吸光值；A2為2 mL桑黃多糖+2 mL95%乙醇的吸光值；A3為2 mL蒸餾水+2 mL DPPH的吸光值。

1.4 抗羥其自由基活性測定

參照Smirnoff等（1989）報道的方法［8］。取用蒸餾水配制的不同濃度桑黃多糖溶液1 mL，加入6 mmol/L FeSO4溶液1 mL，混勻后加入6 mmol/L H2O2溶液1 mL，混勻后靜置10 min，加入6 mmol/L水楊酸1 mL，混勻后37℃水浴反應30 min，3000 rpm離心10 min，取上清液于510 nm處測量吸光值Ai，以蒸餾水替換桑黃多糖液作為陰性對照組，以蒸餾水替換水楊酸作為空白對照組，以維生素C為陽性對照組，試驗重復三次，按下公式計算羥基自由基清除率：

羥基自由基清除率（%）=［A0-（Ai-Aj）］/A0×100%，式中Ai為桑黃多糖組吸光值；A0為陰性對照組吸光值；Aj為空白對照組吸光值。

1.5 還原能力測定

參考李慎新等（2008）［9］的方法。用蒸餾水配制不同濃度的桑黃多糖溶液，取桑黃多糖液0.75 mL，依次加入0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.6）0.75 mL和1%鐵氰化鉀溶液0.75 mL，混勻后于50℃的水浴鍋中反應20 min，再加入10%三氯乙酸溶液0.75 mL，混勻后于3000 rpm離心10 min，取上清液1.5 mL，依次加入蒸餾水1.5 mL和0.1%FeCl3溶液0.1 mL，混勻，于700 nm下測定吸光值，吸光值越高則代表該化合物還原能力越強，試驗重復三次。

1.6 數據統計分析

采用Excel和SPSS v20.0軟件對試驗數據進行統計分析，處理間差異采用LSD（Least Significant Difference）法比較，顯著性水平P＜0.05，極顯著水平P＜0.01。

2 結果與分析

2.1 桑黃多糖對DPPH自由基的清除作用

測定桑黃多糖對DPPH自由基的清除作用，結果如表1所示。表1顯示，桑黃多糖對DPPH自由基的清除率隨著多糖濃度的增大而逐漸升高，表現較好的量效關系（相關系數R2=0.9955）；陽性對照維生素C對DPPH自由基的清除率高于桑黃多糖，表現出很強的清除作用。結果表明，桑黃多糖對DPPH自由基具有較強的清除作用。

表1 桑黃多糖抗DPPH自由基的活性Table 1 Anti-DPPH Function of PBPP

2.2 桑黃多糖對羥基自由基的清除作用

檢測桑黃多糖對羥基自由基（·OH）的清除作用，結果桑黃多糖對羥基自由基的清除率隨著多糖濃度的增大而升高，濃度與清除率間表現出良好的量效關系（相關系數R2=0.9770）；桑黃多糖對羥基自由基的清除率低于陽性對照維生素C（表2）。結果表明，桑黃黃酮對羥基自由基表現出較好的清除作用。

表2 桑黃多糖的抗羥自由基活性Table 2 Anti-hydroxyl Radical Function of Pbpp

2.3 桑黃多糖的還原能力

從表3可知，桑黃多糖的總還原力隨著多糖濃度的增大而逐漸升高，并且表現出較好的線性關系（相關系數R2=0.9798）；桑黃多糖的還原力在低濃度（0.05 mg/mL）時基本與陽性對照維生素C的相近，隨著濃度的升高，其還原力低于維生素C的幅度逐漸拉大。結果表明，桑黃多糖具有較強的還原能力。

表3 桑黃多糖的還原能力Table 3 Reducion Ability of Pbpp

3 討論

多糖是除蛋白質和核酸以外的另一類重要生物大分子，廣泛存在于植物、動物和微生物中，具有免疫調節、抗病毒、降血糖、抗炎、抗癌、抗氧化防衰老等廣泛的藥理作用，而且毒副作用極小，所以成為當今醫藥研究與應用的熱點［10］。多糖種類繁多，不同有機體中存在不同種類與結構的多糖，即表現出不同的藥理作用。本試驗從總還原力、DPPH自由基清除率和羥基自由基清除率這三個方面，檢測了桑黃多糖的抗氧化作用，發現桑黃多糖具有良好的體外抗氧化性能，研究結果豐富了桑黃的基礎藥理學，并為桑黃多糖的產業化開發提供了理論依據。

DPPH是一種非常穩定的自由基，在515 nm處有特征性吸收，當孤對電子被中和后，DPPH的深紫色變淺或消失，所以常用于物質抗氧化活性的體外檢測［11］。羥基自由基（·OH）是活性最強的一種自由基，能誘導膜系統的氧化損傷，從而危害生物體，誘發腫瘤、糖尿病、高血壓等疾病，促進機體衰老［12］。還原力是反映一種物質抗氧化能力的一個很重要的指標，它能夠反映此物質的供電子能力，進而反映出此物質的抗氧化活性［13，14］。本研究發現，桑黃多糖具有較強的還原力以及對DPPH自由基和羥基自由基的清除能力，并且其還原力和自由基清除能力與其濃度呈量效關系，顯示出良好的體外抗氧化作用。盡管桑黃多糖抗氧化活性弱于陽性對照維生素C，但在一定濃度范圍內能夠抑制自由基引起的氧化損傷，這對于離體大面積篩選抗氧化藥物有一定的價值。體外抗氧化作用只反映出抗氧化性能的一個方面，所以要全面了解桑黃多糖的抗氧化性能，還需要結合體內外動物模型以及更多技術指標來進行全面完整的評價，此方面的工作有待深入研究。