張 帥章超樺,2,3,4高加龍,2,3,4秦小明,2,3,4鄭惠娜,2,3,4郝記明,2,3,4張 靜,2,3,4

(1. 廣東海洋大學食品科技學院，廣東 湛江 524088；2. 廣東省水產品加工與安全重點實驗室， 廣東 湛江 524088；3. 廣東普通高等學校水產品深加工重點實驗室，廣東 湛江 524088； 4. 國家貝類加工技術研發分中心〔湛江〕，廣東 湛江 524088)

據WHO統計[1]，早在2010年中國15歲以上人群人均消耗純酒精量就高達6.7 L，而且呈逐年上升趨勢。過量飲酒會造機體酒精中毒，引起組織器官或者免疫改變，導致各種酒精性疾病。2016年全球有300多萬人因過量飲用酒精而死亡[2]。目前對于急性酒精性肝病的預防及治療的研究很多，其中包括不少對天然提取物解酒護肝的研究，如葛根、枳椇子[3]、姜黃[4]、朝鮮薊[5]等植物提取物，玉米肽、大豆肽等小分子多肽物質[6]12-24，牡蠣[7]、珍珠貝[8]、貽貝[9]、河蜆[10-13]等水產動物酶解產物或提取物。

河蜆(Corbiculafluminea)，雙殼類軟體動物，又稱黃蜆、扁螺等，常棲息于淡水或咸淡水中，其可食部位味道鮮美，營養豐富，蛋白含量高且富含多種必需氨基酸。《本草綱目》中記載，河蜆具有治肝病、解酒毒等療效[14]。張磊等[10]和王一錚等[11]研究表明河蜆水提物對小鼠急性乙醇肝損傷具有保護作用，未涉及其解酒功效。劉晶晶等[12]和朱小燕等[13]研究表明河蜆酶解產物具有醒酒功效，但其是否具有抗急性酒精性肝損傷功效尚不清楚。采用酶解技術處理河蜆肉，會得到大量功能性氨基酸和肽，同時能釋放多糖等其他活性物質于酶解產物中，本研究擬將從食品化學角度對河蜆肉酶解產物的基本營養成分和氨基酸組成進行分析，并分別采用體外和體內試驗法系統研究河蜆肉酶解產物對乙醇脫氫酶(ADH)激活率、對小鼠的防醉醒酒和抗急性酒精性肝損傷的影響，為開發河蜆解酒護肝產品提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑

鮮活河蜆(Corbiculafluminea)：購于廣州市黃沙市場，開殼取肉后200 g分裝，儲存于-40 ℃冰箱待用；

雄性昆明小鼠：SPF級，許可證號SCXK(京)2014-0004，質量18～22 g，中國醫學科學院醫學試驗動物研究所；

中性蛋白酶、堿性蛋白酶：2.0×105U/g，廣西龐博生物科技有限公司；

乙醇脫氫酶(ADH)：300 U/mg，美國Sigma公司；

血乙醇測定試劑盒、乙醇脫氫酶測定試劑盒、丙二醛測定試劑盒、甘油三酯測定試劑盒、還原型谷胱甘肽測定試劑盒：南京建成生物科技有限公司；

紅星二鍋頭：56% vol，北京紅星股份有限公司；

陽性藥物：河蜆姜黃肝臟水解物糖丸(含肝臟酶解物、河蜆提取物、牡蠣肉濃縮提取物和姜黃濃縮提取物等)，日本オリヒロプランデュ株式會社；

其他試劑均為分析純。

1.1.2 主要儀器設備

旋轉蒸發儀：R-1005型，鄭州長城科工貿有限公司；

高速落地離心機：Thermo Lynx6000型，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；

真空冷凍干燥機：FDU-1100型，東京理化器械株式會社；

高速氨基酸分析儀：835-50型，日立儀器(上海)有限公司；

多功能酶標儀：Varioskan Flash型，賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 河蜆肉酶解產物制備 參照林孌等[15]河蜆肉酶解工藝方法，冷凍河蜆肉解凍后，按料水比1∶3 (g/mL)加水勻漿，調整pH至7.0，按原料質量1.3%加入混合酶(堿性蛋白酶∶中性蛋白酶質量比3∶1)，于53 ℃恒溫搖床中反應260 min，然后沸水浴滅酶10 min，置冰浴中冷卻后以5 000 r/min離心20 min，收集上清液，測得水解度為31.6%，真空濃縮后冷凍干燥得到河蜆肉酶解產物干粉供試驗備用。

1.2.2 基本成分測定

(1) 水分：按GB 5009.3—2016的常壓干燥法執行。

(2) 粗蛋白：按GB 5009.5—2016的自動凱氏定氮儀法執行。

(3) 粗脂肪：按GB 5009.6—2016的索氏抽提法執行。

(4) 總糖含量：按GB/T 9695.31—2008的苯酚硫酸法執行。

(5) 灰分：按GB 5009.4—2016的高溫灼燒法執行。

(6) 非蛋白氮：采用三氯乙酸沉淀法[16]。

1.2.3 氨基酸組成分析 采用氨基酸自動分析儀測定，其中水解氨基酸參照GB 5009.124—2016方法，游離氨基酸測定參照文獻[17]。

1.2.4 ADH激活率測定 參照文獻[6]17。

1.2.5 小鼠給酒量選擇 體重18～22 g SPF小鼠，暫養3 d 后，取30只隨機分為3組，禁食(不禁水)12 h后稱重，按體重分別灌胃0.14，0.16，0.18 mL/10 g·BW 紅星二鍋頭。參照高加龍[18]的方法，以翻正反射為指標觀察小鼠是否醉酒，記錄小鼠醉酒只數和死亡只數，選擇醉酒率較高、死亡率較低的劑量為最適給酒量。

1.2.6 灌胃劑量確定 陽性對照組藥物濃度0.03 g/mL，是成人劑量的10倍，具有蛋白質、氨基酸等含氮物質。河蜆酶解物組灌胃劑量按陽性對照中氮含量進行配置。

1.2.7 小鼠防醉試驗和解酒試驗 將30只SPF雄性小鼠隨機分為3組，即陰性組、陽性組和河蜆組，每組10只，禁食(不禁水)12 h后稱重，按照體重分別灌胃0.1 mL/10 g·BW的蒸餾水、陽性藥物和河蜆肉酶解產物，其中陽性藥物和河蜆酶解產物的濃度分別為0.03，0.01 g/mL；初次灌胃30 min后，灌胃0.16 mL/10 g·BW的紅星二鍋頭。利用翻正試驗觀察判斷小鼠醉酒狀態，記錄小鼠從灌酒到翻正反射消失(醉酒)所需時間和翻正反射消失(醉酒)到恢復(醒酒)所需時間。

1.2.8 急性飲酒小鼠血液乙醇濃度的測定 將30只SPF雄性小鼠隨機分為3組(陰性組、陽性組和河蜆組)，每組10只，按照1.2.6方法灌胃。在灌胃60 min后對各組小鼠眼球取血，采用血乙醇測定試劑盒測小鼠血液乙醇濃度。

1.2.9 河蜆酶解產物對小鼠急性酒精性肝損傷預防效果

將40只SPF雄性小鼠隨機分為4組(空白組、陰性組、陽性組和河蜆組)，每組10只。每天上午灌胃前稱量體重。陰性組、陽性組和河蜆組按照1.2.6方法分別灌胃蒸餾水、陽性藥物和河蜆肉酶解產物，30 min后灌胃0.12 mL/10 g·BW 的紅星二鍋頭，連續灌胃7 d；空白組每天灌胃蒸餾水。末次灌胃后引頸處死，解剖取肝臟組織，測定丙二醛(MDA)、甘油三酯(TG)、谷胱甘肽(GSH)等生化指標，具體方法參照試劑盒說明書。

1.3 數據處理

2 結果分析

2.1 河蜆肉酶解產物基本營養成分

河蜆肉酶解產物基本營養成分見表1。按干基計，河蜆肉酶解產物同牡蠣肉酶解產物[19]相比，其粗蛋白含量較高，為56.61%；總糖含量低于牡蠣肉酶解產物，為30.82%；粗脂肪和灰分含量與牡蠣肉酶解產物較接近。可見河蜆肉酶解物干粉是一種蛋白含量高，脂肪低并富含豐富礦物質的營養價值很高的酶解蛋白粉。

2.2 河蜆肉酶解產物氨基酸組成

食物蛋白質中的氨基酸是機體不可缺少的營養成分之一，對機體各種生理功能具有重要意義。如表2所示，可以看到河蜆肉酶解產物氨基酸種類齊全，水解氨基酸中必需氨基酸與總氨基酸比值為43.18%，必須氨基酸與非必須氨基酸比值為75.95%，符合FAO/WHO推薦標準中理想蛋白模式[20]。河蜆肉酶解產物中的游離氨基酸含量較高，占總氨基酸的51.86%，說明河蜆肉經過酶解產生了豐富的氨基酸。有報道稱賴氨酸[21]、脯氨酸[22]以及丙氨酸[23]等氨基酸可能與醒酒作用有關，牡蠣肉酶解產物[19]游離氨基酸中賴氨酸、脯氨酸和丙氨酸的占比分別為9.54%，5.27%，8.24%，對比可以發現河蜆肉酶解產物中與解酒作用有關的氨基酸含量是相當豐富的。有研究[24]表明目前臨床上常用于治療肝病的藥物有天門冬氨酸—鳥氨酸二肽注射液，可改善肝病患者的肝功能，促進肝細胞自我修復和再生。如何使河蜆中富集更多的氨基酸和多肽片段，利用蛋白酶對河蜆肉進行酶解是一個很好的選擇。

表1 河蜆肉酶解產物與其他貝類酶解產物的一般營養成分含量

表2 河蜆肉酶解產物氨基酸組成?

? *為必需氨基酸。

2.3 河蜆肉酶解產物體外對ADH活性的影響

解酒護肝研究的經典評價方法是體內試驗法(動物模型)，但該方法試驗周期較長，目前常用瓦勒—霍赫法[25]并稍加改良后測定ADH的活性，來高效快速測定樣品是否有解酒活性。劉鵬[6]19-20研究表明大豆肽和玉米肽對ADH的活性具有促進作用。蘆潔等[26]利用體外ADH激活率的方法，證實白豆蔻、復方解酒保肝茶、葛花水提物和市售葛花王水提取物對ADH活性具有促進作用。本研究采用體外試驗法對受試樣品活性進行初步測定，再進一步對樣品進行體內活性評價。由圖1所示，河蜆組對ADH激活率為52%，且高于陽性組(P<0.05)。從本試驗數據得出河蜆肉酶解產物對ADH具有激活作用。

2.4 河蜆肉酶解產物對急性飲酒小鼠的防醉及解酒效果

2.4.1 小鼠給酒量選擇 為了確定急性飲酒小鼠的醉酒劑量，將30只小鼠按照1.2.5 中所述方法進行灌酒試驗，所得結果如表3所示。

小鼠灌酒劑量過高會酒精中毒死亡，灌酒劑量偏低小鼠不會醉酒或醉酒只數較少。由表3可知，灌酒0.14 mL/10 g·BW 后醉酒只數為6只，灌酒0.16，0.18 mL/10 g·BW 后小鼠全部醉酒。觀察發現灌酒0.14 mL/10 g·BW 小鼠醉酒后睡眠淺，心臟跳動加快，個別出現興奮和急躁，而另外2個劑量的小鼠醉酒后出現沉睡，翻正反射消失，且0.18 mL/10 g·BW組有3只死亡。因此，選擇小鼠的醉酒劑量為0.16 mL/10 g·BW。

不同字母表示組間差異有統計學意義(P<0.05)

Figure 1 Effect of hydrolysate from soft tissue ofCorbiculaflumineaon ADH activation rate in vitro

表3 小鼠給酒量選擇結果

2.4.2 對小鼠醉酒時間和醒酒時間的影響 如表4所示，與陰性組相比，河蜆組和陽性組均能延長小鼠的醉酒時間(P<0.05)，二者無顯著性差異；與陰性組比較河蜆組醉酒時間延長率為69.42%。與陰性組相比，河蜆組和陽性組均能縮短小鼠的醒酒時間(P<0.05)，二者無顯著性差異；與陰性組比較河蜆組醒酒時間縮短率為13.40%。試驗結果表明河蜆肉酶解產物能延長小鼠的醉酒時間和縮短醒酒時間。

2.4.3 對急性飲酒小鼠血液乙醇濃度的影響 乙醇經口腔進入胃、小腸、大腸和十二指腸之后，一小部分經胃腸道中的ADH進行第一關卡代謝，然后排出體外；但大部分乙醇會被胃腸道吸收，進入血液，經循環到達肝臟中進行代謝。圖2是小鼠在飲酒后第60 min的血液乙醇濃度，與陰性組相比，陽性組和河蜆組均能顯著降低小鼠血液乙醇濃度(P<0.05)，二者無顯著性差異。左光揚等[8]和韓麗娜[27]的研究表明，醒酒物可以通過促進乙醇代謝的方式降低小鼠血液乙醇的含量。本研究結果表明河蜆肉酶解產物可以降低急性飲酒小鼠血液乙醇濃度。

表4 河蜆肉酶解產物對小鼠醉酒和醒酒時間的影響?

? 不同字母表示組間差異有統計學意義(P<0.05)。

不同字母表示組間差異有統計學意義(P<0.05)

Figure 2 Effect of hydrolysate from soft tissue ofCorbiculaflumineaon the concentration of ethanol in serum of acute drunken mice

2.5 對小鼠急性酒精性肝損傷預防效果

飲酒會對機體的肝組織造成損傷，主要是通過乙醇代謝物對肝臟的損傷，如：乙醛的化學性損傷、氧化還原反應的改變、氧化應激與脂質過氧化、線粒體損傷和鐵負荷等[28]，通過對肝臟生化相關指標的測定，來驗證這些損傷反應是否發生，或者有無變化，從而來證明灌胃樣品是否對機體急性酒精性肝損傷起著積極的預防效果。根據《保健食品檢驗與評價規范》的判定方法，肝組織MDA、TG和GSH 3項檢測指標其中任意2項結果為陽性，即可判定該物質對酒精性肝損傷具有輔助保護功能[29]。

2.5.1 對肝臟組織中MDA的影響 乙醇在肝臟進行代謝會產生大量的自由基，而自由基會誘導肝細胞脂質過氧化產生MDA等物質[30]。所以MDA作為脂質過氧化的標志性產物，其含量的多少也代表著肝細胞脂質過氧化的程度，從而間接地反映了肝細胞的受損程度。由圖3(a)所示，河蜆組小鼠肝臟組織中的MDA含量顯著小于陰性組(P<0.05)，說明河蜆肉酶解產物能緩解急性飲酒小鼠肝臟組織中MDA的累積。

2.5.2 對肝臟組織中TG的影響 機體在大量飲酒后，乙醇會在乙醇脫氫酶的催化下大量地脫去氫原子被氧化，導致三羧酸循環發生障礙，脂肪酸氧化減弱，從而影響脂肪的代謝，而且乙醇可致磷酸甘油增多而促進甘油三酯的合成，致使脂肪在肝細胞內沉積，TG含量增多[31]。如圖3(b)所示，河蜆組小鼠肝臟組織中的TG含量顯著小于陰性組(P<0.05)，說明河蜆肉酶解產物能降低急性飲酒小鼠肝臟組織中TG的含量。

2.5.3 對肝臟組織中GSH的影響 GSH在機體中起著很多有益的生化作用，它是抗氧化劑同時又是自由基的清除劑，能保護細胞的完整性，對維持細胞的正常代謝起著一定的作用。乙醇經體內代謝后可產生大量的自由基，對機體造成毒害作用，但GSH能清除自由基保護機體不受損傷[32]。由圖3(c) 所示，陰性組小鼠肝臟組織中GSH的含量低于空白組(P<0.05)，反映了陰性組小鼠因飲酒造成了GSH的大量消耗，含量降低，河蜆組小鼠肝臟組織中GSH的含量多于陰性組(P<0.05)，且與空白組無顯著性差異(P>0.05)。

不同字母表示組間差異有統計學意義(P<0.05)

Figure 3 Effect of hydrolysate from soft tissue ofCorbiculaflumineaon liver tissue MDA,TG and GSH of acute drunken mice

3 結論

河蜆肉酶解物是一種蛋白含量高，脂肪低的酶解蛋白粉，其游離氨基酸含量占總氨基酸的51.86%。通過體外測定法檢出河蜆肉酶解產物對ADH具有激活作用；通過體內活性評價顯示河蜆肉酶解產物可顯著延長小鼠的醉酒時間和縮短醒酒時間，證明其具有防醉及醒酒功效。同時相關生化指標表明，其能顯著降低小鼠血液乙醇濃度，且能降低小鼠肝組織中MDA、TG的含量，減緩GSH的消耗。表明河蜆肉酶解產物具有解酒護肝的功效，但其具體功效成分有待進一步研究探明。