奶粉中羥基磷灰石成分的檢測

朱麗嫻林勤保鐘懷寧王 亮潘靜靜,3

(1. 暨南大學包裝工程研究所產品包裝與物流廣東普通高校重點實驗室，廣東 珠海 519070； 2. 廣東檢驗檢疫技術中心廣東省動植物與食品進出口技術措施研究重點實驗室，廣東 廣州 51632； 3. 暨南大學食品科學與工程系，廣東 廣州 510632)

受國際環保團體“地球之友”委托，美國亞利桑那州立大學的納米技術團隊[1]測試了7款在售的澳洲嬰兒配方奶粉，其中3種含有納米羥基磷灰石，2種含有針狀羥基磷灰石納米微粒。羥基磷灰石[HA，Ca5(PO4)3或者是Ca5(PO4)3(OH)]是一種常見的磷酸鈣礦物質，可以作為食品中的發酵劑、牙膏中的磨光材料、蔬菜罐頭中的抗氧劑和結構穩定劑等。有人[2]將碳酸鈣、檸檬酸鈣、羥基磷灰石等形式的含鈣物質作為鈣補充劑，而澳新食品標準法典不允許在嬰兒奶粉中添加針狀納米羥基磷灰石，或其他形態的羥基磷灰石作為補鈣劑[3]，因有研究[4]表明納米羥基磷灰石會造成老鼠肝細胞和腎細胞的死亡。據歐盟消費者科學委員會[4]報告表明，針狀羥基磷灰石具有潛在的毒性，應禁止用于化妝品、牙膏、漱口水等產品中，因為它的尺寸、形狀和結晶度都是未知的，而美國亞利桑那州立大學的納米技術團隊[1]的測試結果發現被禁用于化妝品和日用品的物質存在于嬰兒奶粉中，引起人們的擔憂。

納米技術的發展在不同領域得到了廣泛應用，納米工程材料作為食品添加劑是其主要用途之一，二氧化硅納米材料和二氧化鈦納米材料是食品添加劑及日用品中常見的納米材料，有學者[5-7]利用ICP-MS或Single-particle ICP-MS測定食品中二氧化硅和二氧化鈦的含量，同時利用掃描電子顯微鏡、透射電子顯微鏡對其進行形態和納米尺寸的表征，食品中納米材料的檢測具有一定的挑戰，納米材料的安全性評估需要更多的研究[8-10]。中國對羥基磷灰石的研究在于其制備及表征[11-12]，王宇明等[12]制備了納米羥基磷灰石并利用X射線衍射等手段對其進行表征；對于奶粉中納米羥基磷灰石的檢測中國尚未進行研究，因針狀納米羥基磷灰石的安全性存在一定的爭議，對奶粉中是否含有納米羥基磷灰石的研究很有必要。

本研究擬選用市售5種奶粉(嬰幼兒奶粉和成人奶粉)，通過分離提取奶粉中的無機成分富含物后，利用X射線粉末衍射儀對其中的無機成分富含物進行定性分析，以及用電子顯微鏡觀察提取物的尺寸和形態；同時對空白奶粉樣品進行加標試驗，采取相同的分離提取方法后進行XRD測試和電子顯微鏡觀察表征，以驗證方法的可行性。旨在為奶粉中納米成分的檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

5種奶粉樣品：京東超市，分別標記為S1～S5，S1和S2為嬰幼兒奶粉，S3～S5為成人奶粉；

納米羥基磷灰石標準品：純度為99%，針狀，20 nm，北京百靈威科技有限公司。

1.2 儀器與設備

超純水器：EPED-10TS型，南京易普達科技發展有限公司；

超聲波清洗機：LABUY-10LHT型，杭州萊博儀器設備有限公司；

真空冷凍干燥機： LABOGENE CS55-4型，丹麥Labogene 公司；

雙光路粉末X射線衍射儀：D8 ANVANCE TWIN TWIN型，德國布魯克AXS公司；

電子分析天平：FA1604N型，精度0.000 1 g，上海菁海儀器有限公司；

傅里葉變換紅外光譜儀：Nicolet iS50型，美國熱電公司；

高速冷凍離心機：TGL-16gR型，上海安亭科學儀器廠；

掃描電子顯微鏡：XL-30E型，荷蘭Philips公司；

透射電子顯微鏡(連接能譜儀)：JEOL-2100F型，日本電子株式會社。

1.3 方法

1.3.1 羥基磷灰石的提取 分別稱取S1～S5 5種奶粉樣品各6 g(精確到0.01 g)于100 mL玻璃燒杯中，加入40 mL 超純水后搖勻，將燒杯置于超聲機中超聲分散處理(功率80 W，30 min)，使得奶粉中有機成分和無機成分分散更均勻；將燒杯中樣品轉移至多個10 mL離心管中，進行離心處理(轉速10 000 r/min，溫度20 ℃，25 min)，用于除去奶粉中較輕的成分，合并收集多個離心管底部的成分，并用超純水沖洗2～3次；將沖洗后的底部成分置于真空冷凍干燥機中進行干燥處理(溫度-50 ℃以下，12 h)[1]。

1.3.2 粉末X射線衍射儀和傅里葉變換紅外光譜儀分析

按照1.3.1的步驟提取奶粉樣品中的羥基磷灰石，取適量的冷凍干燥后的樣品研磨成粉末后進行X射線粉末衍射分析。粉末X射線衍射儀的工作電壓和電流分別為40 kV和40 mA，測量的衍射角度范圍2θ為10°～70°，每步掃描時間為5 s，得到的結果圖與標準物質的衍射圖比較[1]。

取少量1.3.1冷凍干燥后的樣品與溴化鉀混合研磨成粉末后壓片進行傅里葉變換紅外光譜儀分析，光譜范圍為400～4 000 cm-1[13]。

1.3.3 電子顯微鏡分析 掃描電子顯微鏡樣品處理，取少量1.3.1冷凍干燥后的樣品和加標樣品于粘有導電膠的銅臺上，進行噴金處理增加樣品的導電性，置于掃描電子顯微鏡中進行觀察。

透射電子顯微鏡樣品處理，取少量1.3.1冷凍干燥后的樣品和加標樣品于離心管中，加入適量的無水乙醇，振蕩搖勻，并吸取少量滴到銅網上，待干燥后進行透射電鏡觀察，并對確定部位使用能譜儀進行元素成分分析。

1.3.4 加標試驗 稱取空白奶粉樣品(S2)并加入針狀納米羥基磷灰石標準品(20 nm)共6 g于100 mL玻璃燒杯中，使得加入的羥基磷灰石標準品與空白奶粉樣品的質量比分別為0.1%，0.3%，0.8%，經1.3.1步驟進行處理后，進行粉末X射線衍射儀分析、掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡(連接能譜儀)觀察。

1.4 數據處理

X射線粉末衍射圖及紅外光譜圖的圖像處理均采用美國OriginLab公司的Origin 9.0版本。

2 結果與分析

2.1 方法驗證

圖1為空白加標樣品的X射線粉末衍射圖，可以看出羥基磷灰石標準品在2θ衍射角度10°～70°時具有多個特征衍射峰，其中30°～35°時出現的3個衍射峰和25°～26°時出現的1個衍射峰相對于其他衍射峰高，這4個衍射峰對應的衍射角度是羥基磷灰石的特征峰角度(與國際衍射數據中心，ICDD數據庫中羥基磷灰石標準物質的衍射圖相同)。3種加標濃度0.1%，0.3%，0.8%(羥基磷灰石標品與空白奶粉樣品的質量比)樣品的X射線粉末衍射圖與羥基磷灰石標準品的衍射圖相近，均在25°～26°時1個角度和30°～35°時的3個角度出現了衍射特征峰，且加標空白樣品中的其他衍射峰與羥基磷灰石的相對應(圖中*標出的峰)，可以判定3種加標空白樣品的X射線粉末衍射圖即為羥基磷灰石的衍射圖。加標試驗結果表明，空白樣品中添加不同濃度的納米羥基磷灰石樣品，經過超聲分散、離心、冷凍干燥等處理后沒有對羥基磷灰石的化學結構造成改變，且加標濃度為0.1%時，經過一系列提取處理后，加標空白樣品中仍能檢測出羥基磷灰石標準品。由此，加標試驗驗證了超聲分散、離心、冷凍干燥等步驟提取奶粉中的羥基磷灰石，利用X射線粉末衍射儀測定羥基磷灰石的方法可行。

圖2、3可以看出添加了羥基磷灰石標準品后的空白樣品S2經1.3.4步驟處理后提取到的成分，在電子顯微鏡下能觀察到納米針狀羥基磷灰石標準品，透射電子顯微鏡下能清楚地看到添加到空白樣品中的羥基磷灰石標準品的形態(針狀)和尺寸(20 nm左右)。

*代表衍射峰

Figure 1 X-ray diffraction patterns of dominant mineral content separated from blank added labeling sample and hydroxyapatite standard reference

圖2 空白樣品S2加HA標品提取的礦物質成分

Figure 2 SEM of dominant mineral content separated from blank sample S2 added hydroxyapatite standard reference

圖3 空白樣品S2加HA標品提取的礦物質成分

Figure 3 TEM of dominant mineral content separated from blank sample S2 added hydroxyapatite standard reference

2.2 奶粉樣品檢測

2.2.1 X射線粉末衍射 5種奶粉樣品的X射線粉末衍射圖如圖4所示。從圖4中可以看出，S1的X射線衍射圖在25°～26°時的1個角度和30°～35°時的3個角度均出現了衍射特征峰，與羥基磷灰石標準品的特征峰對應的特征衍射角度相近，可以初步推斷奶粉樣品S1中含有羥基磷灰石這種物質。而奶粉樣品S2、S3、S4和S5的X射線衍射圖中沒有出現羥基磷灰石標準品對應的特征衍射峰，因此不含有羥基磷灰石。奶粉樣品S3、S4和S5的衍射圖相似，都在29°～30°時出現了特征衍射峰，對比ICDD數據庫中方解石01-081-2027標準物質的衍射圖，可以初步確定樣品S3、S4和S5中含有碳酸鈣的方解石晶體。由圖4可知，未經超聲、離心處理的奶粉樣品的XRD粉末衍射圖中沒有出現尖的衍射峰，而是無定形樣品的小鼓包，說明奶粉樣品直接做XRD粉末衍射測試時，其中的晶態成分會被無定形的成分裹住而干擾了晶態成分的衍射。

*代表衍射峰

Figure 4 X-ray diffraction patterns of dominant mineral content separated from sample S1～S5 and hydroxyapatite standard reference

2.2.3 電子顯微鏡觀察 奶粉樣品S1提取物在透射電子顯微鏡下未能觀察到針狀納米尺寸的羥基磷灰石，但含有未知結構的類似于球狀的納米成分(圖6)，能譜儀(Energy Disperse Spectroscopy，EDS)結果顯示該納米顆粒的元素組成為C、O、P、Cl(圖7)，因羥基磷灰石結構中鈣、磷元素的含量應較多，與圖7中納米顆粒的元素組成比例不同，可見該納米成分并非羥基磷灰石，其具體結構有待進一步深入研究。

圖5 樣品S2、S3中提取的礦物質成分和羥基磷

Figure 5 FTIR spectra of dominant mineral content separated from S2, S3 and hydroxyapatite standard reference

圖6 樣品S1提取的礦物質成分TEM圖

圖7 樣品S1提取的礦物質成分TEM圖及EDS圖

3 結論

針狀納米羥基磷灰石的安全性存在著一定的爭議，本研究通過超聲分散、離心、冷凍干燥，分離提取奶粉中富含無機物的成分，利用X射線粉末衍射儀對提取物進行定性分析，并用電子顯微鏡觀察提取物尺寸和形態；所檢測的奶粉樣品中，樣品S1中含有羥基磷灰石(非納米尺寸)，并含有類似球狀未知結構的納米成分(元素組成為C、O、P、Cl)，樣品S2未發現含有晶體狀羥基磷灰石，初步確定樣品S3、S4、S5含有碳酸鈣的方解石晶體。由于納米成分的小尺寸效應等使得其理化性質不同于常規尺寸的物質；奶粉(特別是嬰幼兒奶粉)的安全性直接影響著嬰兒的健康，對于奶粉中納米尺寸成分的檢測需要引起學者的更多關注。

由于EDS只能確定樣品中的元素組成及各元素所占比例，本研究未能對S1中出現的球狀納米成分進行定性分析；對于其他樣品中可能存在的納米成分分析同樣可選擇本研究的方法進行探究，同時根據樣品中可能存在的納米尺寸物質進行排查篩選。