納豆芽孢桿菌Bacillus natto 16-1對小麥粉中嘔吐毒素的脫毒機制

張 琛 許慧卿 崔桂友 丁香麗 胡 艦 李 波 于小番

(揚州大學旅游烹飪·食品科學與工程學院，江蘇 揚州 225127)

嘔吐毒素又名脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol, DON, 3, 7, 15-三羥基-12, 13-環氧單端孢霉-9烯-8酮)，是由禾谷鐮刀菌Fusariumgraminearum產生的重要真菌毒素[1-2]。嘔吐毒素在小麥、玉米和大豆等常規糧食中普遍存在，是食品和飼料原料中僅次于黃曲霉毒素的最常見的真菌毒素之一，在全球范圍內有著較高的污染率[3]。嘔吐毒素可通過食物鏈對人畜造成很大的危害，能引起動物嘔吐、腹瀉、皮膚刺激、拒食、神經紊亂、流產、死胎等[4-6]。

目前常用的嘔吐毒素脫毒方法有物理、化學和生物法。由于DON的結構十分穩定[7]，物理和化學方法脫毒效果不穩定，同時會破壞食物原料中的營養成分，還容易造成二次污染[8-11]，而微生物降解毒素的方法因其高效環保而受到廣泛的關注，并且有較好的脫毒效果[12-13]。研究發現動物腸道的混合微生物菌團對DON的降解率可接近50%[14-15]，霉菌屬的某些菌株可達到65%以上[16]，芽孢桿菌屬中的某些菌株甚至可達80%以上[17-18]。

雖然上述微生物降解法對DON降解取得了較好的效果，但也存在諸多缺陷。早期研究[15,19-20]發現，能降解DON的微生物大多是源于動物腸道的混合菌群不能進行純培養，混合物也不適合進行規模化發酵生產；雖然有部分菌株經純化后可降解DON，但大多數研究[16-17,21]都是用單株菌直接與DON標準品進行試驗，沒有驗證其在食物環境中對DON的降解效果，甚至部分能降解DON的菌株本身就是致病菌、致敏源，存在安全隱患。這些問題直接影響微生物降解法在實踐中的應用。

為探明真菌毒素生物降解的機制和安全有效的途徑，本試驗擬通過研究益生菌納豆芽孢桿菌Bacillusnatto16-1的菌懸液、發酵上清液、全菌裂解液、粗提酶液及細胞壁懸浮液對小麥粉中的嘔吐毒素降解效果，并利用高效液相色譜—質譜聯用儀(LC-MS)對作用結果進行分析，來探討納豆芽孢桿菌不同處理方式對嘔吐毒素的脫毒能力，為真菌毒素生物降解的實踐應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

納豆芽孢桿菌Bacillusnatto16-1(Bn16)：由本實驗室選育保藏；

嘔吐毒素(DON)：美國Sigma公司；

甲醇、氯化鈉：分析純，國藥化學試劑有限公司；

營養肉湯：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化鈉5.0 g，蒸餾水定容至1 L，pH為7.4，121 ℃高壓滅菌20 min；

電子天平：GL124-1SCN型，德國Sartorius公司；

超凈工作臺：SW-CJ-1F型，蘇州凈化有限公司；

全自動滅菌鍋：JF-SX-500型，日本TOMY公司；

超純水儀系統：Millipore Direct 8型，美國Millipore公司；

冷凍離心機：AllegraX-22R型，美國Beckman Coulter公司；

大容量雙層培養搖床：KYC-1102型，新苗醫療器械制造有限公司；

超聲破細胞破碎儀：JY920-IID型，新芝生物科技股份有限公司；

酶標分析儀：ZM-560型，中德伯爾生物技術有限公司；

液相色譜—質譜聯用儀：Agilent 1200-6460 QQQ型，美國Agilent公司。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液及發酵上清液的制備 取穩定生長期(28～38 h)Bn16發酵液，調節菌體濃度至1×1012CFU/mL，然后進行10倍梯度稀釋，分別獲得濃度為1×1012(高濃度)，1×1011(中濃度)，1×1010(低濃度)CFU/mL 3組菌液。將各濃度Bn16發酵液于8 000 r/min離心10 min，分別收集菌體和上清液。菌體用無菌生理鹽水洗滌3次后，再用生理鹽水重懸至原菌體濃度，分別記為高、中、低濃度菌懸液。上清液分別用0.22 μm濾膜(Milipore)過濾，濾液即為高、中、低3個濃度組的發酵上清液。菌懸液和上清液分別于4 ℃保存備用。

1.2.2 全菌裂解液及細胞壁懸浮液的制備 按1.2.1制備Bn16高、中、低濃度菌懸液，反復凍融后，用超聲波細胞破碎儀(輸出功率400 W，間隔時間10 s，每次裂解時間10 s，裂解總時間20 min，保護溫度0 ℃)對菌懸液進行裂解并用顯微鏡檢查裂解效果，再經過濾后收集濾液，然后4 ℃，10 000 r/min離心15 min，分別收集濾液，即為高、中、低濃度的全菌裂解液。對各組沉淀進行洗滌并重懸至原溶液體積，即為高、中、低濃度的細胞壁懸浮液。全菌裂解液和細胞壁懸浮液分別于4 ℃保存備用。

1.2.3 酶液的粗提取 按1.2.1制備Bn16高、中、低濃度發酵液，于4 ℃，12 000 r/min離心20 min，上清液分別用0.45 μm的微孔濾膜過濾[22]，收集濾液，即為高、中、低濃度的粗提酶液，于4 ℃保存備用。

1.2.4 小麥粉樣品制備 取市售小麥粉，測定DON含量，面粉中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇特征值為(2 366±187) μg/kg[23]，根據測定結果適量添加DON標準樣品，調節小麥粉中的DON含量[約為(2.6±0.1) μg/g]，使小麥粉樣品中的DON含量大于特征值，滅菌，40 ℃干燥至恒重。

1.2.5 菌體成分對小麥粉中DON的降解 分別取高、中、低濃度的菌懸液、發酵上清液、全菌裂解液、粗提酶液、細胞壁懸浮液，與上述含有DON的小麥粉樣品按5∶1(mL/g)混合；以添加等體積生理鹽水小麥粉作空白對照，于35 ℃，140 r/min孵育發酵，分別在第5，10 h(穩定期中期和穩定期末期)取樣并測定樣液中DON殘留量。

1.2.6 小麥粉中DON殘留濃度的檢測 按GB 5009.111—2016進行操作。用酶聯免疫吸附測定法(ELISA)檢測樣品中DON殘留量，每組設置3個平行。

參照吳娛等[22]的研究方法，經甲醇粗提乙腈復提后，利用高效液相色譜—質譜聯用儀(HPLC-MS)對降解產物進行分析。

1.3 統計分析

試驗數據采用Excel、ELISA Calc、SPSS等軟件進行計算和統計分析。

Bn16對DON的脫毒效果用清除率表示，按式(1)計算：

(1)

式中：

（2）跟蹤、追究不嚴格。高校審計處根據審計結果出具審計報告，對內部控制設計和執行情況有針對性地提出改善對策和建議，并要求整改。但是內部審計部門出具完審計報告后，跟蹤及追究力度不夠，加之相關部門對審計結果疏于重視，未能及時堵住漏洞，導致風險依舊存在，嚴重影響了內部控制實施的有效性。

CL——DON清除率，%；

w0——對照組樣品中DON含量，μg/10 g；

w1——處理樣中DON殘留量，μg/10 g。

2 結果與分析

2.1 不同濃度納豆芽孢桿菌Bn16菌懸液對DON的脫毒效果

不同濃度的Bn16菌懸液對小麥粉樣品中DON的脫毒效果如表1所示。

由表1可以看出，小麥粉與不同濃度的Bn16菌懸液孵育后，其中的DON濃度均有不同程度的下降，下降的幅度與菌懸液濃度、孵育時間有關。不同濃度處理組的DON清除率均達到53%以上，其中經過10 h孵育后各處理組的DON降解率均達到57%以上。處理10 h不同濃度處理組間清除率并無顯著差異，但不同處理時間對各處理組的DON清除率存在顯著差異，隨處理時間的延長，盡管清除率有所提高，降解速率明顯減緩。以上結果表明，Bn16菌懸液對小麥粉中的DON毒素具有較好的清除作用，這種清除作用在一定時間內與菌濃度有關。

目前，嘔吐毒素的生物脫毒已成為國內外研究的熱點。許多微生物，如酵母菌等真菌和某些細菌均可用于去除或減少食品中的嘔吐毒素。Yu等[19]從雞的腸道內容物中分離到的芽孢桿菌(Bacillus)可在無氧條件下將DON轉化為低毒性的去環氧化合物dE-DON，Li等[24]通過動物試驗證實芽孢桿菌對DON具有降解作用。本試驗中不同濃度的納豆芽孢桿菌Bn16菌懸液對DON均具有一定的清除作用，說明納豆芽孢桿功具有生物降解DON的能力。納豆芽孢桿菌屬革蘭氏陽性菌，是枯草芽孢桿菌的一個亞種，自身無致病性，可降解一些復雜的碳水化合物。Bn16對DON的清除機制有待進一步研究。

2.2 不同濃度納豆芽孢桿菌Bn16發酵上清液對DON的脫毒效果

不同濃度的Bn16發酵上清液對小麥粉樣品中DON的脫毒效果如表2所示。

2.3 納豆芽孢桿菌Bn16全菌裂解液對DON的脫毒效果

不同濃度的Bn16裂解液對小麥粉樣品中DON的脫毒效果如表3所示。

由表3可以看出，小麥粉與不同濃度的Bn16裂解液經過5 h孵育后，DON的清除率達到56%以上，經過10 h 孵育后全菌裂解液對DON清除率最高可達58.59%。10，5 h處理組之間存在顯著差異，但同一處理時間的不同濃度處理組之間差異不顯著。以上結果表明，Bn16的胞內可能含有可清除DON的物質，但是在試驗濃度下，這些物質對DON的清除作用與時間有關，而與菌裂解液濃度無關。

表1 不同濃度Bn16菌懸液對DON的脫毒效果?

? 不同小寫字母表示各試驗組間差異顯著(P<0.05)；“-”表示DON清除率為0%。

表2 不同濃度Bn16發酵上清液對DON的脫毒效果?

? 不同小寫字母表示各試驗組間差異顯著(P<0.05)；“-”表示DON清除率為0%。

表3 不同濃度Bn16全菌裂解液對DON的脫毒效果?

? “-”表示DON清除率為0%。

全菌裂解液主要成分是Bn16細胞器、胞內酶等大分子物質和細胞質中一些小分子物質的混合物，各種物質對DON的清除作用可能處于一個相互制約的過程，因此雖然DON的清除率隨著裂解液濃度的增加而增加，但增加的量并未達到顯著水平。

2.4 不同濃度納豆芽孢桿菌Bn16粗提酶液對DON的脫毒效果

不同濃度的Bn16粗提酶液對小麥粉樣品中DON的脫毒效果如表4所示。

由表4可以看出，小麥粉與不同濃度的Bn16粗提酶液孵育后，DON的清除率均達到62%以上，經過10 h孵育后不同濃度的粗提酶液對DON清除率均有所提高，但增幅較小，各濃度組之間均沒有顯著差異。以上結果表明，Bn16胞外酶對小麥粉中的DON有清除作用，作用效果與DON和酶的作用時間有關。

粗提酶液中主要成分為Bn16的胞外酶，包括脂肪酶和蛋白酶等。研究[25-27]發現真菌中的蛋白酶和脂肪酶等胞外酶類能通過打開DON結構中的環氧鍵或水解DON來降解DON。同時，酶液中可能會有一些其他因子，比如酶的抑制劑一起濾過，在高濃度情況下，酶的抑制劑濃度也高，所以高濃度組在10 h時反而增加不明顯。同時，高濃度組由微生物的生長代謝導致的pH值的變化也更明顯，因此對酶活性的影響也比較大。

2.5 不同濃度納豆芽孢桿菌Bn16細胞壁懸液對DON的脫毒效果

不同濃度的Bn16細胞壁懸液對小麥粉樣品中DON的脫毒效果如表5所示。

表4 不同濃度Bn16粗提酶液對DON的降解效果?

? “-”表示DON清除率為0%。

表5 不同濃度Bn16細胞壁懸液對DON的脫毒效果?

? “-”表示DON清除率為0%。

由表5可以看出，小麥粉不同濃度的Bn16細胞壁懸液經過5 h孵育后，DON清除率均達61.7%以上，且各組清除率無差異；處理10 h后的檢測結果顯示，中、低濃度的細胞壁懸液對DON清除率有所提高，但高濃度則略有下降；這可能與細胞壁懸液的濃度及細胞壁破碎程度有關。以上結果表明，Bn16的細胞壁可降低小麥粉中的DON的含量，作用效果與細胞壁濃度關系不大，只在一定濃度下，清除效果會隨著時間的延長而增加。

目前研究發現，真菌類和一些革蘭氏陽性菌對DON均有吸附作用，這與本試驗的結果基本一致。這種吸附作用是可逆的，因此對吸附時間，吸附劑濃度及穩定性有較高要求。

2.6 不同處理方式DON的脫毒效果比較

Bn16不同細胞成分對小麥粉中的DON的清除效果如表6所示。

由表6可以看出，同一細胞成分與小麥粉混合后，作用10 h后DON的清除率均明顯高于作用5 h的處理，而相同作用時間不同處理濃度之間的差異較小。比較處理10 h后各濃度組的DON清除率，除發酵上清液處理外，其他各組的高濃度組處理效果并不優于中濃度組，說明中濃度組清除DON的能力已接近飽和。比對不同處理的納豆芽孢桿菌Bn16對DON的清除率發現，不同細胞成分對小麥粉中DON的清除效果有明顯的差異，其中粗提酶液與細胞壁懸浮液對DON的清除率顯著高于其他細胞成分處理組，有可能這是Bn16清除DON的2個主要途徑。菌懸液對DON的清除率與細胞壁懸浮液處理相比，存在著較為明顯的差異。說明Bn16對DON的吸附作用并不完全存在于細胞外膜，可能細胞外膜內側或內膜還存在著某些物質，它們對DON有一定的吸附作用。

表6 Bn16不同細胞成分對DON的清除率?

? 不同小寫字母表示同列處理組之間有顯著差異(P<0.05)；不同大寫字母表明同行處理組之間有顯著差異(P<0.05)。

以上結果表明，不管從處理成本還是處理效果來看，中濃度的粗提酶液或細胞壁懸浮液處理10 h對DON清除均能達到較好的效果。

2.7 不同處理方式對DON影響結果比較

采用LC-MS對不同處理組的作用底物進行檢測，檢測結果如圖1所示。

由圖1可知，DON標準品的相對分子質量為293.30，經過Bn16菌懸液、全菌裂解液、粗提酶液的作用后均產生了相對分子質量為277，283左右的新物質；經發酵上清液處理后的樣品只有分子質量283左右的新物質產生，而細胞壁處理組并無新的物質產生。以上結果表明，納豆芽孢桿菌清除DON的機制可能包括生物吸附和生物降解，酶等大分子物質通過生物降解產生2種不同的降解產物，而細胞壁對DON的清除可能只是通過細胞壁成分的吸附作用。本研究中所用的菌懸液并未滅活，因此在5～10 h的作用中，Bn16有可能產生少量酶等胞外物質，因此菌懸液處理出現了2種降解產物。

研究[28-29]證明，微生物細胞壁對DON的清除作用主要是生物吸附。它們是通過細胞壁的肽聚糖、甘露聚糖和葡聚糖等高分子物質對DON的吸附。這與本試驗結果一致。

微生物酶可通過水解和異構化等方式作用于DON的C-12,13環氧基團、C-3羥基等位點進行生物降解[14,25-27]。于大海[30]和Palomo等[31]發現真菌中的脂肪酶具有催化水解環氧化合物的功能，可以將DON轉化為的DOM-1。鄧露芳等[32]和Young等[33]發現DON生物降解的另一條途徑可能是微生物蛋白酶在堿性條件下DON結構中的C12/C13環氧基團發生去環氧化。本試驗中，納豆芽孢桿菌Bn16的粗提酶液處理降解DON后可產生2種產物，但其作用機制究竟是將DON結構中的環氧鍵被打開生成2個羥基，還是通過去環氧化達到水解DON的目的，有待于進一步研究。

3 結論

本試驗通過研究納豆芽孢桿菌Bacillusnatto16-1各細胞成分對小麥粉中DON的清除能力發現，菌懸液、發酵上清液，粗提酶液、全菌裂解液和細胞壁均有清除DON的能力，其中微生物酶和細胞壁是清除DON的主要細胞成分，用1×1011的菌懸液制得的粗提酶液或細胞壁懸浮液與小麥粉樣品按5∶1(g/mL)混合后處理10 h對小麥粉中DON清除能達到較好的效果。同時，本試驗證實了細胞壁和微生物酶類可通過不同的機制清除DON，但對于不同微生物酶降解的DON機制、降解產物以及降解產物的毒性尚需進一步研究。

圖1 Bn16不同細胞成分降解DON的 LC-MS圖譜

利用生物脫毒對糧食進行DON脫毒處理，相較物理、化學脫毒法，不但能避免脫毒處理過程中對食品原料的營養成分的影響，還可提高食品營養價值。通過研究菌體成分對DON的清除作用，可以克服全菌脫毒效果不穩定的局限，也可以突破因細菌特殊氣味導致的接受程度低的限制，應用更加廣泛。因此，研究微生物降解毒素的機制，尋找降解毒素的有效成分進行純化分離以及進一步的改造，將是未來一段時間內真菌毒素生物降解的研究方向。