常壓室溫等離子體誘變選育DHA高產菌株

龔定芳，熊祎楠，孫佼文，史仲平

(江南大學生物工程學院，工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122)

二十二碳六烯酸(DHA)是一種重要的ω-3系列多不飽和脂肪酸，對智力和視網膜的發(fā)育有重要影響[1]。研究表明DHA能抑制癌細胞增殖、抵御炎癥、預防心血管疾病，同時還具有抗皺保濕、防衰老等作用[2]。傳統的深海魚油DHA受到季節(jié)限制、環(huán)境影響，產品性質不穩(wěn)定且?guī)в恤~腥味[3]。裂殖壺菌是一種海洋真菌，因DHA含量高、生長速度快、易于培養(yǎng)、無毒無污染等諸多優(yōu)點而成為當下研究的熱點。野生型裂殖壺菌的DHA產量較低，難以滿足工業(yè)化需求。誘變育種是篩選優(yōu)良菌種的主要手段。

常壓室溫等離子體(ARTP)誘變通過釋放活性粒子，作用于微生物的細胞壁或細胞膜，使其結構和通透性發(fā)生變化，引起基因損傷致使突變[4]。與傳統誘變方法相比，ARTP誘變育種具有突變率高、操作簡便、成本低、無毒無害等優(yōu)點。袁軍等[5]通過ARTP誘變，2，2′- 聯吡啶平板篩選成功獲得高產 DHA 的菌株，DHA產量達到7.31 g/L，比初始菌株提升了29.8%。

本文以裂殖壺菌SR21為出發(fā)菌株，利用ARTP誘變，結合丙二酸、碘乙酸及丙二酸-碘乙酸混合平板的方式進行篩選，并以搖瓶培養(yǎng)的方式考察突變株積累DHA的水平，以期獲得一株高產DHA的菌株。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

裂殖壺菌菌株(SchizochytriumlimacinumSR21)：購自美國菌種保藏中心(ATCC)，-80℃保存于ATCC By+790培養(yǎng)基中?；罨囵B(yǎng)基：ATCC By+790固體培養(yǎng)基。種子培養(yǎng)基：葡萄糖 30 g/L，酵母粉6 g/L，魚粉蛋白胨6 g/L，pH自然，121℃滅菌15 min。發(fā)酵培養(yǎng)基：參考文獻[6]配制。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種培養(yǎng)

將保藏于-80℃條件下的菌種轉接于菌種活化平板上，25℃條件下培養(yǎng)3 d。接種環(huán)刮取一環(huán)，接入裝有50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶，25℃、200 r/min搖床培養(yǎng)48 h。以10%的接種量接種到裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，搖瓶發(fā)酵120 h。

1.2.2 生物量及葡萄糖質量濃度的測定

參考文獻[7]測定生物量及葡萄糖質量濃度。

1.2.3 油脂提取

油脂提取：準確稱取0.05 g菌體于10 mL具塞玻璃試管中，加入1.5 mL蒸餾水，混勻后加入2 mL鹽酸；65℃水浴至菌體完全消化，冷卻至室溫后加入2 mL正己烷-乙醇(2∶1)溶液，搖勻后靜置分層，取上層有機相轉移至新的10 mL玻璃試管中，試管提前稱重，用正己烷-乙醇溶液重復洗滌3次，將有機相合并后，充氮去除溶劑，得到油脂。

1.2.4 脂肪酸組成分析

脂肪酸甲酯化：參照文獻[8]。向待測油脂樣品中加入內標物1 mg/mL十九烷酸1 mL，加入0.5 mol/L NaOH-CH3OH溶液1 mL，60℃水浴振蕩至油珠完全溶解，冷卻后加入14% BF3-乙醚溶液2 mL，60℃水浴酯化20 min，冷卻后加入2 mL正己烷，振搖，渦旋2 min，加入2 mL飽和NaCl溶液振搖，靜置。取1 mL上層有機相于1.5 mL EP管中，加入少許無水Na2SO4以除去微量的水，離心后將樣品稀釋25倍后裝于棕色瓶待測。

利用氣相色譜(日本島津GC-2010PLUS)對脂肪酸進行定量分析，色譜柱Rtx-WAX(30 m×0.32 mm×0.25 μm)，色譜測定條件參照文獻[7] 。

1.2.5 單細胞菌懸液的制備及ARTP誘變

將培養(yǎng)至對數期的菌體接種到鋪有20顆玻璃珠的250 mL三角瓶中，裝液量為50 mL， 25℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)20 min，四層擦鏡紙過濾得到單細胞菌懸液。稀釋一定倍數，使其菌濃度在105～106CFU/mL之間。

將10 μL單細胞菌懸液均勻涂布在金屬載片的上表面，用鑷子將載片轉移至載物臺。ARTP誘變設置參數如下：功率100 W，氣流量10 L/min，照射時間依次為 0(對照)、5、10、15、20、25、30 s。處理后將載片轉移到裝有1 mL生理鹽水的EP管中，振蕩洗脫形成新的菌懸液，涂布平板后25℃培養(yǎng)3 d后對平板菌落進行計數，計算致死率。致死率=(未經誘變處理菌落數-經誘變處理菌落數)/未經誘變菌落數×100%。每組3個平行。

將誘變處理后的菌液轉移到裝有1 mL生理鹽水的EP 管中，振蕩洗脫形成新的菌懸液，稀釋一定倍數，取100 μL菌濃度在105～106CFU/mL之間的菌液涂布于加入一定質量濃度丙二酸、碘乙酸、丙二酸-碘乙酸混合的篩選平板后25℃培養(yǎng)3 d，挑選出生長良好的單菌落進行擴大培養(yǎng)，然后按照1.2.1所述進行搖瓶發(fā)酵，并測定DHA產量。

2 結果與討論

2.1 原始菌株的生長特性

為確定裂殖壺菌SR21對數期時間，每6 h取4 mL培養(yǎng)液，8 000 r/min離心5 min洗滌獲得菌體，凍干至恒重。以生物量為縱坐標，繪制生長曲線如圖1 所示。

圖1 裂殖壺菌SR21生長曲線

從圖1可以看出，菌體在培養(yǎng)12 h后進入快速生長階段，48 h之后逐漸進入穩(wěn)定期。

為確定最佳種齡，選擇對數期中后期幾個時間點的種子液接入搖瓶，進行搖瓶培養(yǎng)，并測定最終的生物量、油脂總量及DHA產量，結果見表1。

表1 種齡對裂殖壺菌SR21發(fā)酵生產DHA的影響

從表1可以看出，種齡為48 h時，生物量、油脂總量和DHA產量均最高。因此，在后續(xù)的研究中種子的培養(yǎng)時間確定為48 h。

以48 h為種齡，對原始菌株進行搖瓶培養(yǎng)，研究其細胞生長、底物消耗及產物合成特性。每隔12 h采集 一次發(fā)酵液樣品，測定生物量、殘?zhí)且约癉HA產量，結果如圖2所示。

圖2 殘?zhí)?、生物量及DHA產量隨培養(yǎng)時間的變化曲線

從圖2可以看出，葡萄糖在120 h時全部耗盡，此時的生物量和DHA產量分別達到30.48、4.51 g/L。以這一批次的搖瓶培養(yǎng)實驗作為后續(xù)誘變和篩菌研究的對照批次，該批次油脂總量為19.36 g/L，并確定后續(xù)研究中的搖瓶培養(yǎng)周期為120 h。

2.2 ARTP誘變時間的確定

ARTP誘變是一種新型的誘變方式，目前廣泛地應用于微生物誘變育種。程功等[9]利用ARTP選育L-高精氨酸和8-氮鳥嘌呤抗性菌株，該菌株的L-精 氨酸產量比出發(fā)菌株提高了49.79%。ARTP誘變處理時間不同，菌株的突變率也不一樣。在不同的誘變時間下，分析菌體的致死率，結果如圖3所示。

圖3 ARTP不同誘變時間下菌體的致死率

從圖3可以看出，在0～15 s內，隨著誘變時間的延長，致死率快速增加，15 s后隨著誘變時間的延長致死率增加緩慢。當誘變時間達到30 s時，致死率達到100%。據文獻[10]報道，當致死率處于85%～95%之間時，可獲得較高的正突變率。誘變時間為15 s時，致死率為88%，因此選用15 s作為后續(xù)誘變的處理時間。

2.3 篩選條件的確定

2.3.1 丙二酸篩選

丙二酸是琥珀酸脫氫酶抑制劑，能夠抑制三羧酸循環(huán)，造成檸檬酸的大量積累。所積累的檸檬酸能夠在檸檬酸裂解酶的作用下生成乙酰-CoA，為脂肪酸的合成提供更多前體物質[11]。將誘變后菌株涂布在添加有不同質量濃度丙二酸平板上，25℃條件下培養(yǎng)3 d，菌株的生長情況如表2所示。

表2 誘變后菌株在不同丙二酸質量濃度平板上的生長情況

注：+.菌落個數在10～25之間；+/-.菌落個數在1～10之間；-.不生長。下同。

從表2可以看出，當丙二酸質量濃度為1.4 g/L時，菌體生長完全被抑制，因此選取1.2 g/L作為篩選平板中丙二酸的添加質量濃度。

2.3.2 碘乙酸篩選

碘乙酸能夠不可逆地抑制脂肪酸合成酶和磷酸甘油醛脫氫酶，從而抑制EMP途徑。經過誘變的菌株，只有少數變異的細胞具有較強的 HMP，能夠在EMP途徑受到抑制后，依靠HMP途徑存活下來。因此，具有碘乙酸抗性的菌株有較強的HMP途徑，能夠提供更多的NADPH，促進脂肪酸的合成，有益于DHA的積累[12]。將誘變后菌株涂布在添加有不同質量濃度碘乙酸平板上，25℃條件下培養(yǎng)3 d，菌株的生長情況如表3所示。

表3 誘變后菌株在不同碘乙酸質量濃度平板上的生長情況

從表3可以看出，當碘乙酸質量濃度為0.14 g/L 時，菌體生長完全被抑制，因此選取篩選平板中碘乙酸的質量濃度為0.12 g/L。

2.3.3 復合篩選

有研究表明，復合因子篩選平板根據雙重作用可以提高篩選效率[13]。對混合篩選平板中丙二酸和碘乙酸的質量濃度進行了研究，組合方式及裂殖壺菌SR21的生長情況如表4所示。

從表4可以看出，在2號和4號平板中菌體致死率均較高，對2號篩選平板和4號篩選平板上的菌落數進行計數，發(fā)現2號平板中的致死率略高于4號。因此，可以確定2號平板的組合為混合平板最佳的組合方式，即碘乙酸質量濃度為0.06 g/L，丙二酸質量濃度為0.4 g/L。

表4 誘變后菌株在不同質量濃度丙二酸-碘乙酸復合篩選平板上的生長情況

2.4 誘變選育

利用上述3種平板(1.2 g/L丙二酸篩選平板、0.12 g/L碘乙酸篩選平板和0.4 g/L丙二酸-0.06 g/L碘乙酸混合篩選平板)篩選后，共獲得27株突變株，其中利用丙二酸篩選得到的8株突變株依次命名為NA1～NA8，利用碘乙酸平板篩選獲得的8株突變株依次命名為NB1～NB8，利用丙二酸-碘乙酸混合平板篩選得到的11株突變株依次命名為NC1～NC11。測定所有誘變菌株經120 h搖瓶發(fā)酵后的生物量、油脂總量及DHA產量，結果如圖4所示。

圖4 誘變菌株經120 h搖瓶發(fā)酵后的生物量、

從圖4可以看出：NA1～NA8經搖瓶培養(yǎng)后生物量差異較小，DHA產量相對較高的3株為NA1、NA2和NA3(圖4(a))； NB1～NB8的生物量差異也較小，DHA產量相對較高的3株為NB4、NB5和NB8(圖4(b))；NC1～NC11的生物量存在較大差異，DHA產量相對較高的3株為NC3、NC4和NC6(圖4(c))。

本實驗選取了每個篩選批次中DHA產量較高的3株菌，比較其發(fā)酵特性，結果如表5所示。

表5 不同篩選方法DHA產量比較

從表5可以看出，丙二酸抗性菌株、碘乙酸抗性菌株和丙二酸-碘乙酸復合抗性菌株的平均DHA產量與出發(fā)菌株相比，分別提高了37.92%、14.41%、7.76%。單一篩選平板選育的菌株其生物量相對穩(wěn)定，且誘變的效果更好，其中丙二酸篩選法對提高DHA的產量有更為明顯的效果。最佳的混合篩選平板質量濃度并不是丙二酸篩選質量濃度與碘乙酸篩選質量濃度的簡單結合，這說明復合篩選平板具有的雙重篩選能力具有更強的致死效應，致死率過高，往往產生的負突變更多，這可能是復合篩選平板效果并不理想的原因。本實驗最終確定以DHA產量最高的NA2作為后續(xù)研究的出發(fā)菌株。

2.5 遺傳穩(wěn)定性

對菌株NA2進行連續(xù)傳代培養(yǎng)(即將平板上活化的菌落接種到另一個平板上進行培養(yǎng)的過程，轉接一次為一代，以此類推)，以4℃冰箱保存且生長良好的第二代菌株為對照，連續(xù)傳代5次。對每一代菌株進行搖瓶培養(yǎng)，DHA產量如表6所示。

表6 NA2傳代5次的測定結果

從表6可以看出，DHA產量并沒有隨著傳代次數的增加而出現明顯的下降趨勢，因此可以證明突變株NA2具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

3 結 論

以裂殖壺菌SR21為出發(fā)菌株，經ARTP誘變15 s，稀釋一定倍數，使其菌濃度在105～106CFU/mL之間，取100 μL涂布于1.2 g/L丙二酸篩選平板上，搖瓶發(fā)酵120 h后測定誘變株的生物量、油脂總量、DHA產量。最終獲得突變株NA2，其生物量、油脂總量、DHA產量達到36.00、22.24、6.59 g/L，與原始菌株相比分別提高18.11%、14.87%和46.12%。傳代5次后，NA2遺傳性狀穩(wěn)定。