火麻葉中大麻二酚的熱回流法提取工藝研究

高 哲，張志軍，李曉君，李會(huì)珍

(中北大學(xué) 化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院，太原 030051)

火麻(CannabissativaL.)最早源于中亞，又名大麻、漢麻、線麻，是一年生草本植物，其莖皮纖維長而堅(jiān)韌，可用作織麻布、制繩索和造紙等；其種子含油量達(dá)30%，油中富含多不飽和脂肪酸，其中α-亞麻酸、γ-亞麻酸、亞油酸總含量達(dá)76%～82%，高于其他常見油脂，具有極高的營養(yǎng)價(jià)值。火麻作為纖維、食物的來源已經(jīng)有3 000多年的歷史[1]。火麻葉中有多種大麻素類化合物，主要是大麻二酚及其羧基化合物。大麻二酚是非成癮性成分，具有阻斷某些多酚對(duì)人體神經(jīng)系統(tǒng)的不利影響，并且具有治療糖尿病、阻斷乳腺癌轉(zhuǎn)移、抗痙攣、抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、抗失眠等一系列生理活性功能[2-5]。近年來，科學(xué)家們也將大麻二酚應(yīng)用于臨床試驗(yàn)從而更好地研究其抑菌、抗炎、抗癌等活性，為人類健康發(fā)展提供有效保障[7-13]。因此，大麻二酚的提取制備得到廣泛重視。

目前大麻二酚提取工藝主要為酶輔助溶劑法[1]、超聲輔助溶劑法[2，12]及超臨界CO2萃取法[13]。本試驗(yàn)選用既適合實(shí)驗(yàn)室又廣泛應(yīng)用于規(guī)模化工業(yè)生產(chǎn)中的熱回流法[14]，先確定最優(yōu)提取溶劑再通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定火麻葉中大麻二酚提取的最佳工藝條件，同時(shí)建立氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)對(duì)浸膏中的大麻二酚進(jìn)行定量分析。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

火麻葉：榆社縣田禾綠色食品有限公司；大麻二酚標(biāo)準(zhǔn)品：國家食品藥品檢定所；正己烷、石油醚、無水乙醇(分析純)；甲醇(色譜級(jí))。

1.1.2 儀器與設(shè)備

FA1204B分析天平：上海精科天美科學(xué)儀器有限公司；JM-B-2002電子天平：余姚市紀(jì)銘稱重設(shè)備有限公司；BJ-400型高速多功能粉碎機(jī)：北京普朗新技術(shù)科學(xué)儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；SHZ-Ⅲ循環(huán)水真空泵：上海知信實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)有限公司；GZX-9070MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SB-5200超聲波清洗機(jī)：寧波新芝生物科技有限公司；TRACE1300/ISQ氣質(zhì)聯(lián)用儀：Thermo Fisher。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

色譜條件：色譜柱為Agilent HP-5毛細(xì)管柱(30 m×0.2 mm×0.11 μm)；載氣為氦氣，流速1.5 mL/min；柱溫程序?yàn)槠鹗紲囟?20℃，保持1 min，以4℃/min升溫至160℃，以13℃/min升溫至275℃，保持3 min；進(jìn)樣口溫度230℃；檢測器接口溫度280℃；分流比5∶1；進(jìn)樣量1 μL。

質(zhì)譜條件：電子轟擊(EI)離子源，離子源溫度230℃；四級(jí)桿溫度150℃；質(zhì)譜TIC模式；掃描范圍(m/z)200～500；溶劑延遲時(shí)間3 min。

稱取0.010 0 g大麻二酚標(biāo)準(zhǔn)品，以甲醇定容制成母液(1 mg/mL)，分別取50、100、150、200、250、300 μL，均放置于10 mL容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度為5、10、15、20、25、30 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。按上述氣相色譜-質(zhì)譜條件進(jìn)行檢測，以大麻二酚質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 火麻葉前處理

火麻葉經(jīng)篩選后60℃烘干至恒重，然后置于高速多功能粉碎機(jī)中粉碎，分別過60、40、20目篩制備得到60、40、20目火麻葉粉及20目篩上物，密封保存于冰箱冷藏備用。

1.2.3 大麻二酚的提取和測定

分別稱取不同粒徑火麻葉粉，按一定料液比加入提取溶劑，在設(shè)定的溫度、時(shí)間下熱回流提取，冷卻抽濾，將濾液在40℃下旋蒸濃縮制得浸膏。浸膏得率按下式計(jì)算：

Y=G1/G2×100%

式中：Y為浸膏得率，%；G1為浸膏的質(zhì)量，g；G2為樣品質(zhì)量，g。

分別準(zhǔn)確稱取0.01 g浸膏，向其中加入10 mL甲醇，置于40 kHz超聲波清洗機(jī)中，條件設(shè)置為功率200 W、溫度20℃、時(shí)間3 min，之后過0.45 μm有機(jī)膜，所得濾液通過氣相色譜-質(zhì)譜檢測并按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算浸膏中大麻二酚的含量。

同時(shí)在選擇提取溶劑的基礎(chǔ)上，以浸膏得率及浸膏中大麻二酚含量為指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)對(duì)過篩粒徑、料液比、提取溫度和提取時(shí)間4個(gè)因素進(jìn)行考察，并采用正交試驗(yàn)進(jìn)行工藝優(yōu)化。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析

所有提取試驗(yàn)均重復(fù)3次，每次浸膏得率及大麻二酚含量的測定均重復(fù)3次，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示。應(yīng)用SPSS軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析并作圖，利用置信度為95%的最小顯著性差異(P<0.05)比較平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 大麻二酚標(biāo)準(zhǔn)曲線

以大麻二酚質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到大麻二酚標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=4.909×106X+3.119×106，相關(guān)系數(shù)為R2=0.993 1，在5～30 μg/mL之間線性關(guān)系良好。

2.2 提取溶劑的選擇

準(zhǔn)確稱取粒徑為20目的火麻葉粉，每份40 g，分別以正己烷、石油醚、無水乙醇作為提取溶劑，在料液比1∶15、提取時(shí)間3 h、提取溫度80℃下進(jìn)行提取，考察提取溶劑對(duì)浸膏得率及大麻二酚含量的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 提取溶劑對(duì)浸膏得率及大麻二酚含量的影響

由圖1可知，無水乙醇提取的浸膏得率最高，但其大麻二酚含量僅有19.70 mg/g，可能是無水乙醇極性偏大，導(dǎo)致醇溶性雜質(zhì)、色素溶出[15]，正己烷和石油醚提取的浸膏得率差異不顯著，但正己烷提取的大麻二酚含量明顯高于石油醚。方差分析結(jié)果顯示3種提取溶劑對(duì)浸膏中的大麻二酚含量影響達(dá)到顯著水平(P<0.05)，因此選擇正己烷為提取溶劑。

2.3 單因素試驗(yàn)

2.3.1 過篩粒徑對(duì)大麻二酚提取的影響

準(zhǔn)確稱取一定量火麻葉粉，以正己烷為提取溶劑、料液比1∶10為提取溶劑量，在80℃下熱回流提取3 h，考察過篩粒徑對(duì)浸膏得率及大麻二酚含量的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 過篩粒徑對(duì)浸膏得率及大麻二酚含量的影響

由圖2可知，20目篩上物的浸膏得率及大麻二酚含量均最低，分別為3.15%、15.04 mg/g，與另外3種不同粒徑火麻葉粉相比差異顯著(P<0.05)，這是由于物料與溶劑未能充分接觸從而阻礙了有效成分的溶出。20、40目和60目相比對(duì)浸膏得率及大麻二酚含量的影響差異不顯著，但考慮到粒徑較大時(shí)選用普通的雙聯(lián)過濾器即可實(shí)現(xiàn)后續(xù)工藝的固液分離，具有成本低、能耗低等優(yōu)點(diǎn)；粒徑過小時(shí)通常需選擇板框壓濾機(jī)、臥螺離心機(jī)等能耗高的儀器實(shí)現(xiàn)固液分離，因此將火麻葉粉粒徑控制在20目即可。

2.3.2 料液比對(duì)大麻二酚提取的影響

準(zhǔn)確稱取粒徑為20目的火麻葉粉，以正己烷為提取溶劑，在80℃下熱回流提取3 h，考察料液比對(duì)浸膏得率及大麻二酚含量的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 料液比對(duì)浸膏得率及大麻二酚含量的影響

由圖3可知，采用正己烷以料液比1∶10、1∶15、1∶20 提取時(shí)浸膏得率及大麻二酚含量沒有顯著差異，但顯著高于料液比1∶5時(shí)的浸膏得率及大麻二酚含量(P<0.05)。研究表明料液之間的濃度梯度是提取物發(fā)生轉(zhuǎn)移的動(dòng)力，通過提高料液比，可以增加濃度梯度，有利于提取物的溶出。但當(dāng)料液比達(dá)到某一值時(shí)，再提高料液比效果不大[16]，之后有減小的趨勢，這可能是由于大麻二酚易氧化轉(zhuǎn)變成另一種物質(zhì)[17]。考慮到溶劑損耗、濃縮時(shí)間、工藝成本等問題，料液比確定為1∶10。

2.3.3 提取溫度對(duì)大麻二酚提取的影響

準(zhǔn)確稱取粒徑為20目的火麻葉粉，以正己烷為提取溶劑、料液比1∶10為提取溶劑量，在一定提取溫度下熱回流提取3 h，考察提取溫度對(duì)浸膏得率及大麻二酚含量的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 提取溫度對(duì)浸膏得率及大麻二酚含量的影響

由圖4可知，提取溫度從60℃升至85℃，浸膏得率僅增加了0.89個(gè)百分點(diǎn)，但大麻二酚含量相應(yīng)地從27.85 mg/g提高到34.39 mg/g，提取溫度為80、85℃時(shí)大麻二酚含量穩(wěn)定在34.39 mg/g左右。有報(bào)道指出，溫度是提取過程中重要的影響因素，升高提取溫度能夠增加溶質(zhì)的溶解度與溶解系數(shù)，有利于提取，但是超過一定的溫度后，酚類物質(zhì)就會(huì)發(fā)生降解[18]。故選擇80℃作為提取溫度。

2.3.4 提取時(shí)間對(duì)大麻二酚提取的影響

準(zhǔn)確稱取粒徑為20目的火麻葉粉，以正己烷為提取溶劑、料液比1∶10為提取溶劑量，在80℃下熱回流提取一段時(shí)間，考察提取時(shí)間對(duì)浸膏得率及大麻二酚含量的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 提取時(shí)間對(duì)浸膏得率及大麻二酚含量的影響

由圖5可知，在3 h內(nèi)，提取時(shí)間對(duì)浸膏得率及大麻二酚含量影響顯著(P<0.05)，隨著提取時(shí)間的延長，大麻二酚含量先呈上升的趨勢，提取時(shí)間為3 h時(shí)含量最高，顯著高于1、2 h(P<0.05)，分別比提取1、2 h時(shí)高出了83.89%和22.45%。3.5 h時(shí)大麻二酚含量略微下降0.26 mg/g，可能是由于大麻二酚本身具有還原性，含有的兩個(gè)酚羥基可以作為H供體，易被空氣中的氧氣所氧化。所以提取時(shí)間控制在3 h為宜。

2.4 正交試驗(yàn)優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以浸膏得率及大麻二酚含量為指標(biāo)，選用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)火麻葉中大麻二酚提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果如表1所示。

表1 火麻葉中大麻二酚提取正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表1可知，4個(gè)因素對(duì)浸膏得率的影響程度由高到低依次為料液比>提取時(shí)間>過篩粒徑>提取溫度，4個(gè)因素對(duì)大麻二酚含量的影響程度由高到低依次為料液比>提取時(shí)間>提取溫度>過篩粒徑，提取最佳條件組合為A2B3C2D2，即過篩粒徑20目、料液比1∶15、提取溫度80℃、提取時(shí)間3 h。

利用SPSS軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表2、表3。

表2 浸膏得率方差分析

由表2、表3可知：料液比對(duì)浸膏得率及大麻二酚含量的影響均達(dá)到極顯著水平(P<0.01)；提取時(shí)間對(duì)浸膏得率的影響達(dá)到極顯著水平(P<0.01)，對(duì)浸膏中大麻二酚含量的影響達(dá)到顯著水平(P<0.05)；提取溫度對(duì)浸膏得率及大麻二酚含量的影響均達(dá)到顯著水平(P<0.05)；過篩粒徑對(duì)浸膏得率的影響達(dá)到顯著水平(P<0.05)，而對(duì)大麻二酚含量的影響不顯著。

表3 大麻二酚含量方差分析

對(duì)最佳試驗(yàn)條件進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，測得浸膏得率為5.24%，大麻二酚含量為46.16 mg/g。試驗(yàn)提取的大麻二酚含量低，仍含有較多雜質(zhì)，可以通過層析法、重結(jié)晶法等方法對(duì)其進(jìn)行純化，以提高大麻二酚純度。

3 結(jié) 論

以火麻葉為原料，探討了提取溶劑、過篩粒徑、料液比、提取溫度及提取時(shí)間對(duì)大麻二酚提取的影響，確定了最佳的工藝條件：正己烷作為提取溶劑，火麻葉粉碎過20目篩后按料液比1∶15熱回流提取3 h，提取溫度控制在80℃。在最佳工藝條件下，浸膏得率為5.24%，浸膏中大麻二酚含量為46.16 mg/g。