虹鱒魚(yú)油的超聲波輔助法提取及其脂肪酸組成分析

趙保堂，孫 棟，劉 東，劉倩霞，楊富民，張 繼

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州 730070； 2.甘肅特色植物有效成分制品工程技術(shù)研究中心，蘭州 730070)

虹鱒魚(yú)是世界名貴魚(yú)種之一，在我國(guó)廣泛養(yǎng)殖[1]。虹鱒魚(yú)肉質(zhì)細(xì)嫩，含脂量多，維生素D、鐵元素含量遠(yuǎn)高于其他食品，而且油脂不飽和脂肪酸含量較高，食用后可降低人體血脂水平和軟化血管，可用于預(yù)防心臟病、高血壓等，并可促進(jìn)大腦與視網(wǎng)膜發(fā)育[2]。因此，虹鱒魚(yú)油的的研究開(kāi)發(fā)具有良好的市場(chǎng)前景。

超聲波是一種高頻率的機(jī)械振蕩波，通過(guò)產(chǎn)生空穴效應(yīng)強(qiáng)化萃取效果和萃取效率[3]。楊小克[4]研究了魷魚(yú)內(nèi)臟油脂的提取方法、脂肪酸組成及理化性質(zhì)，在提高魚(yú)油提取率的同時(shí)，明確提取方法對(duì)脂肪酸組成及理化性質(zhì)的影響。魏永生等[5]對(duì)虹鱒魚(yú)肌肉脂肪酸進(jìn)行了GC-MS分析，其中不飽和脂肪酸含量較高，含有豐富的亞麻酸。孫麗霞等[6-7]采用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取羅非魚(yú)內(nèi)臟油脂工藝，并用不同方法提取了羅非魚(yú)內(nèi)臟油脂和對(duì)脂肪酸組成進(jìn)行分析，結(jié)果表明超聲輔助提取法可縮短魚(yú)油提取時(shí)間，減少溶劑用量，提高魚(yú)油提取率。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)魚(yú)油的提取分析有很多的文獻(xiàn)報(bào)道，但對(duì)于虹鱒魚(yú)油的超聲輔助提取研究鮮有報(bào)道。本文以虹鱒魚(yú)內(nèi)臟為原料，以石油醚為提取溶劑，比較分析超聲功率、超聲時(shí)間、超聲溫度、提取次數(shù)、液料比對(duì)魚(yú)油提取率的影響。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，以魚(yú)油提取率為指標(biāo)，通過(guò)響應(yīng)面分析法優(yōu)化工藝條件，獲得超聲波輔助法提取虹鱒魚(yú)油的最佳工藝條件，并對(duì)虹鱒魚(yú)油的脂肪酸組成、過(guò)氧化值、酸價(jià)等進(jìn)行分析，為后續(xù)的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

虹鱒魚(yú)內(nèi)臟：購(gòu)于蘭州市永登縣，去除膽囊及腸道內(nèi)消化物，洗凈瀝干，并用絞肉機(jī)絞碎成糜狀，冷藏備用。

無(wú)水乙醇、甲醇、異辛烷，均為色譜純；乙醚、石油醚(沸程60～90℃)、氫氧化鉀、鹽酸、硫酸氫鈉、硫酸鈉、三氯甲烷、冰乙酸、碘化鉀、硫代硫酸鈉，均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

GC-MS 6800氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：江蘇天瑞儀器股份有限公司；SB-5200DTS超聲波清洗機(jī)：寧波新芝生物科技有限公司；FA1104N電子分析天平：上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；RE-52C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海青浦滬西儀器廠；循環(huán)水式真空泵：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 虹鱒魚(yú)內(nèi)臟含油量測(cè)定

準(zhǔn)確稱取虹鱒魚(yú)內(nèi)臟5.0 g，用濾紙包裹嚴(yán)實(shí)，置于索氏抽提器中，加入石油醚使包裹物完全浸沒(méi)在石油醚中，水浴加熱圓底燒瓶提取8 h，將提取后的液體用分液漏斗分離水分后，減壓蒸發(fā)揮去石油醚，稱量產(chǎn)物質(zhì)量，計(jì)算虹鱒魚(yú)內(nèi)臟的含油量。

1.2.2 虹鱒魚(yú)油的超聲波輔助提取

準(zhǔn)確稱取虹鱒魚(yú)內(nèi)臟5.0 g置于50 mL錐形瓶中，根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件加入石油醚，設(shè)定好超聲儀器條件置于其中，超聲完畢后抽濾去除殘留物，將提取后的液體用分液漏斗分離水分后，轉(zhuǎn)入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀揮去石油醚，稱量魚(yú)油質(zhì)量，計(jì)算虹鱒魚(yú)油的提取率。以虹鱒魚(yú)油提取率為指標(biāo)，考察超聲時(shí)間、液料比、超聲功率、提取次數(shù)、超聲溫度對(duì)虹鱒魚(yú)油提取率的影響，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

虹鱒魚(yú)油提取率=提取的魚(yú)油質(zhì)量/內(nèi)臟含魚(yú)油質(zhì)量×100%

1.2.3 酸價(jià)和過(guò)氧化值的測(cè)定

分別按照GB 5009.229—2016、GB 5009.227—2016測(cè)定虹鱒魚(yú)油的酸價(jià)、過(guò)氧化值。

1.2.4 脂肪酸組成的測(cè)定

脂肪酸甲酯的制備：參考張靜等[8]的方法制備脂肪酸甲酯。

GC條件：RTX-5MS 型彈性石英毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；程序升溫為柱溫160℃，保留2 min，然后以5℃/min 升至210℃，保持3 min，再以1℃/min 升至220℃，保持1 min，最后以5℃/min 升至250℃，保持1 min；進(jìn)樣量2.5 μL。

MS條件：離子源為EI源，離子源溫度250℃，傳輸線溫度250℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 超聲溫度對(duì)虹鱒魚(yú)油提取率的影響

在超聲時(shí)間30 min、液料比10∶1、超聲功率150 W、提取次數(shù)1次的條件下，考察超聲溫度(20、30、40、50、60℃)對(duì)虹鱒魚(yú)油提取率的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 超聲溫度對(duì)提取率的影響

由圖1可知，隨著超聲溫度的升高，提取率呈現(xiàn)增大的趨勢(shì)，當(dāng)超聲溫度為50℃時(shí)，提取率達(dá)到最大，之后提取率開(kāi)始下降。這是因?yàn)樵诔暅囟壬叩倪^(guò)程中增加了溶劑分子和油脂分子的動(dòng)能，使擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)能夠進(jìn)行，進(jìn)而魚(yú)油的提取率升高，此后升高超聲溫度對(duì)提取率無(wú)顯著作用[9]。因此，最佳超聲溫度確定為50℃。

2.1.2 超聲時(shí)間對(duì)虹鱒魚(yú)油提取率的影響

在超聲溫度50℃、液料比10∶1、超聲功率150 W、提取次數(shù)1次的條件下，考察超聲時(shí)間(10、20、30、40、50、60 min)對(duì)虹鱒魚(yú)油提取率的影響，結(jié)果如圖2 所示。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響

由圖2可知，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，提取率呈現(xiàn)增大的趨勢(shì)，當(dāng)超聲時(shí)間超過(guò)50 min時(shí)，提取率變化不大。這可能是因?yàn)殡S著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，在超聲波的空穴效應(yīng)下，虹鱒魚(yú)內(nèi)臟中越來(lái)越多結(jié)締組織被打斷，將更多魚(yú)油釋放出來(lái)；但虹鱒魚(yú)內(nèi)臟中的魚(yú)油是有限的，當(dāng)釋放到一定程度后，隨超聲時(shí)間延長(zhǎng)虹鱒魚(yú)油提取率增大不顯著[10]。因此，最佳超聲時(shí)間確定為50 min。

2.1.3 液料比對(duì)虹鱒魚(yú)油提取率的影響

在超聲時(shí)間50 min、超聲功率150 W、提取次數(shù)1次、超聲溫度50℃的條件下，考察液料比(4∶1、6∶1、8∶1、10∶1、12∶1)對(duì)虹鱒魚(yú)油提取率的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 液料比對(duì)提取率的影響

由圖3可知，隨著液料比的增加，提取率呈現(xiàn)增大的趨勢(shì)，當(dāng)液料比為10∶1時(shí)，提取率最大。液料比的大小決定了提取溶劑與虹鱒魚(yú)內(nèi)臟接觸程度的大小，液料比增大增加了虹鱒魚(yú)內(nèi)臟與溶劑間的濃度差，提高了油脂向溶劑擴(kuò)散的速率，從而使提取率增大，當(dāng)溶劑與魚(yú)油的比率達(dá)到飽和時(shí)，液料比將不再影響提取率[11]。因此，最佳液料比確定為10∶1。

2.1.4 超聲功率對(duì)虹鱒魚(yú)油提取率的影響

在超聲時(shí)間50 min、液料比10∶1、提取次數(shù)1次、超聲溫度50℃的條件下，考察超聲功率(100、125、150、175、200、225、250 W)對(duì)虹鱒魚(yú)油提取率的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 超聲功率對(duì)提取率的影響

由圖4可知，隨著超聲功率的增加，提取率呈現(xiàn)增大的趨勢(shì)，當(dāng)超聲功率為175 W時(shí)，提取率達(dá)到最大，之后提取率開(kāi)始下降。這是由于超聲功率的強(qiáng)度對(duì)提取率有著決定性作用，超聲功率越大，空化作用與機(jī)械作用越激烈，界面擴(kuò)散層上的分子擴(kuò)散越快，但是超聲功率過(guò)大，超聲波的傳播衰減將增大，導(dǎo)致提取率增加緩慢甚至下降[12-13]。因此，最佳超聲功率確定為175 W。

2.1.5 提取次數(shù)對(duì)虹鱒魚(yú)油提取率的影響

在超聲時(shí)間50 min、液料比10∶1、超聲功率175 W、超聲溫度50℃條件下，考察提取次數(shù)(1、2、3、4次)對(duì)虹鱒魚(yú)油提取率的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5 提取次數(shù)對(duì)提取率的影響

由圖5可知，隨著提取次數(shù)的增加，提取率呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，這主要是由于隨著提取次數(shù)的增加，石油醚與魚(yú)油的結(jié)合次數(shù)增加，使虹鱒魚(yú)內(nèi)臟中的魚(yú)油充分釋放，提取率逐漸變大，但過(guò)多的提取次數(shù)使后續(xù)處理步驟增加，不利于工業(yè)化生產(chǎn)，且提取次數(shù)的增加對(duì)提取率的增加影響不顯著[14]。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中提取次數(shù)確定為1次。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

以單因素實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)，選取液料比(X1)、超聲時(shí)間(X2)、超聲溫度(X3)和超聲功率(X4)4個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)，考察其對(duì)虹鱒魚(yú)油提取率的影響，以優(yōu)化虹鱒魚(yú)油提取工藝條件，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素與水平如表1所示。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素與水平

2.2.2 統(tǒng)計(jì)分析和模型擬合

采用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

對(duì)表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到虹鱒魚(yú)油提取率(Y)對(duì)液料比(X1)、超聲時(shí)間(X2)、超聲溫度(X3)和超聲功率(X4)的二次多項(xiàng)回歸方程為：

運(yùn)用Design-ExpertV8.0軟件對(duì)表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到虹鱒魚(yú)油提取率回歸方程的方差分析如表3所示。

表3 方差分析

注：P<0.000 1，差異高度顯著，用**表示；P<0.05，差異顯著，用*表示。

2.2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

采用將回歸方程各自應(yīng)變量取一階偏導(dǎo)為零，得到的超聲波輔助法最佳提取條件為提取次數(shù)1次、超聲功率199.97 W、超聲時(shí)間57.8 min、超聲溫度54.62℃、液料比11.98∶1。為了實(shí)際操作的便利，取超聲波輔助法最佳工藝條件為提取次數(shù)1次、超聲功率200 W、超聲時(shí)間58 min、超聲溫度55℃、液料比12∶1。在此基礎(chǔ)上對(duì)優(yōu)化后的工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，重復(fù)3次取平均值，虹鱒魚(yú)油提取率為95.10%。

所得虹鱒魚(yú)油為棕黃色，稍有渾濁沉淀，具有一般魚(yú)油的腥味，其酸價(jià)(KOH)為3.708 mg/g、過(guò)氧化值為1.516 mmol/kg,均符合SC/T 3502—2016粗魚(yú)油一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，可作為一種較好的食用油脂。

2.3 虹鱒魚(yú)油脂肪酸組成

超聲波輔助法提取的虹鱒魚(yú)油脂肪酸組成測(cè)定結(jié)果如表4所示。

表4 虹鱒魚(yú)油脂肪酸組成

由表4可知，超聲波輔助法提取所得虹鱒魚(yú)油主要有8種脂肪酸，包括12-甲基-十三烷酸、軟脂酸、亞油酸、亞麻酸、油酸、硬脂酸、EPA、DHA，其中亞油酸是主要的多不飽和脂肪酸，亞油酸含量為26.42%，亞麻酸含量為9.24%，EPA含量為1.12%，DHA含量為4.45%。單不飽和脂肪酸是油酸，含量為20.09%。因此，可以將虹鱒魚(yú)作為多不飽和脂肪酸的來(lái)源，其在營(yíng)養(yǎng)保健和藥用領(lǐng)域?qū)?huì)有良好的發(fā)展前景[15]。

3 結(jié) 論

采用超聲波輔助法提取虹鱒魚(yú)油，采用單因素實(shí)驗(yàn)考察了超聲溫度、超聲功率、超聲時(shí)間、提取次數(shù)及液料比對(duì)虹鱒魚(yú)油提取率的影響。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面法優(yōu)化虹鱒魚(yú)油超聲波輔助法提取工藝條件，得到最佳工藝條件為提取次數(shù)1次、超聲功率200 W、超聲時(shí)間為58 min、超聲溫度55℃、液料比12∶1，在此條件下虹鱒魚(yú)油提取率為95.10%。虹鱒魚(yú)油酸價(jià)和過(guò)氧化值符合粗魚(yú)油一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)(SC/T 3502—2016)。虹鱒魚(yú)油中亞油酸、亞麻酸、EPA、DHA含量分別為26.42%、9.24%、1.12%和4.45%，油酸含量為20.09%。