柴胡皂甙D經mTOR通路抑制A549細胞的上皮間質轉化

史小東，鄭金旭，錢海，楊磊，孫金玲

（1.江蘇大學附屬醫院呼吸內科，江蘇 鎮江212001；2.江蘇大學醫學院，江蘇 鎮江212013）

特發性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一種病因不明、進展迅速、不可逆、預后極差的慢性肺疾病。生長因子及其胞內的下游信號通路等多種因素可以促進纖維化的進展［1］。IPF過程中肺組織損傷及其生理功能異常的特點是肺泡上皮細胞發生上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），形成遷移能力強的間充質類細胞。轉化生長因子β1（TGF-β1）是可誘導肺泡上皮細胞發生EMT的最經典生長因子之一［2］。發生EMT時上皮細胞標志物E-鈣黏蛋白等表達下調，間質細胞標志物α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）等表達上調［3］。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶家族的成員，是細胞內調控細胞代謝、生長、增殖和凋亡的信號途徑之一。近年來相關研究發現mTOR信號通路異常與肺纖維化發生有關［4］。Nistala等［5］研究發現，發生IPF時組織細胞內mTOR信號通路活化，但具體機制尚不明確。

柴胡皂甙D（saikosaponins D，SSd）是從中藥柴胡中提取分離出來的有效成分，具有抗纖維化、抗炎、抗腫瘤等作用［6-7］。SSd治療肺纖維化小鼠模型可取得與激素類似的療效［8］，但具體作用機制，尤其是否通過相關信號通路而阻斷EMT尚不明確。本實驗通過TGF-β1刺激體外培養的A549細胞建立EMT模型，并予SSd干預，檢測細胞內mTOR、p70S6及EMT發生時α-SMA、N-鈣黏蛋白、Ⅰ型膠原蛋白、E-鈣黏蛋白的表達，進一步探討SSd經mTOR通路對EMT過程的可能影響。

1 材料與方法

1.1 材料

非小細胞肺腺癌A549細胞株購于中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。SSd（南京靈寶生物科技公司）；重組TGF-β1、p-mTOR、p70S6兔來源多克隆抗體、E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白（CST公司）；Ⅰ型膠原蛋白、α-SMA（武漢博士德生物工程公司）。

1.2 細胞培養

將人肺癌細胞株A549置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液中，于5%CO2、37℃條件下，每2天換1次培養液，0.25%胰蛋白酶消化細胞進行傳代培養。

1.3 SSd的配制

將20 mg SSd用780μL DMSO稀釋為終濃度2 mmol／L的濃縮液。實驗使用時予RPMI 1640工作液稀釋至需要濃度。

1.4 MTT實驗檢測細胞增殖

取對數生長期的A549細胞，分為5組，用胰蛋白酶常規消化，離心收集細胞沉淀。用含10%胎牛血清的DMEM培養液重懸制成細胞懸液，計數細胞并調整細胞密度至1×104／mL，接種于96孔板中，每孔加入100μL，每組設3個復孔。培養12 h后，改用無血清DMEM培養液，饑餓細胞12 h。其中4組加入TGF-β1（10 ng／mL）4μL刺激A549細胞24 h后，再予不同終濃度SSd（0、0.5、1.0、2.0μmol／L）作用24 h。培養結束后分別每孔加入20μL MTT溶液，置37℃培養箱孵育4 h，棄去培養液。每孔加入100μL DMSO，振蕩20 min，使紫色結晶物甲臜液溶解充分后在酶聯免疫儀上490 nm波長測定光密度（D）值。在相同條件下重復實驗3次，對照組也以同樣方法進行測定。

1.5 蛋白質印跡檢測mTOR信號通路及EMT相關蛋白

1.5.1 細胞處理及蛋白提取 分別取對數生長期的A549細胞，常規消化細胞接種6孔板，以10 ng／ml的TGF-β1刺激24 h，用不同濃度（0.5、1.0、2.0 μmol／L）的SSd溶液作用于細胞，培養24 h后，棄培養液，用預冷的PBS洗滌細胞1～2遍，吸干PBS后加入100μL煮沸的2×SDS-上樣緩沖液裂解細胞，收集細胞，加入1.5 mL離心管中，干式恒溫器100℃煮沸蛋白5 min，再用超聲儀破碎細胞10 s，于4℃，12 000×g離心5 min，-20℃冰箱待檢。

取對數生長期的A549細胞，常規消化細胞接種6孔板，以10 ng／mL的TGF-β1刺激24 h，再用1 μmol／L SSd溶液作用于細胞8 h、12 h、24 h后，棄培養液，用預冷的PBS清洗細胞1～2遍，吸干后按上述方法提取蛋白。

1.5.2 蛋白質印跡 根據上述分離蛋白分子質量的大小，配制相應濃度的分離膠及濃縮膠。加樣后，濃縮膠以70 V恒壓積聚蛋白，再以120 V電壓在分離膠中分離蛋白。電泳結束后將PVDF膜貼于目標蛋白對應大小的標準參照物上，轉膜條件為恒流350 mA、4℃、2 h，轉膜結束后用含5%BSA的封閉緩沖液室溫封閉1 h。按說明書要求稀釋抗體并室溫孵育一抗mTOR、p70S6、α-SMA、N-鈣黏蛋白、Ⅰ型膠原蛋白、E-鈣黏蛋白抗體及內參β-肌動蛋白（1∶1 000）4 h，然后用TBST洗滌膜3次。用TBST按1∶5 000的比例稀釋辣根過氧化物酶標記的二抗，置搖床室溫孵育1 h，快速洗膜3次。最后在膜表面加入曝光液后于化學發光成像系統中掃描條帶。

1.6 統計學分析

應用SPSS 17.0軟件進行統計分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SSd抑制TGF-β1誘導的A549細胞增殖

MTT結果顯示，與對照組相比，TGF-β1（10 ng／mL）刺激A549細胞24 h后，細胞的增殖能力顯著上升（t＝0.000 214，P＜0.05）。與TGF-β1刺激組比較，TGF-β1+SSd組細胞增殖能力明顯降低，且隨著SSd劑量的增加，抑制效果逐漸增強（F ＝67.33，P＜0.05）。見圖1。

圖1 不同濃度SSd對TGF-β1作用下A549細胞增殖能力的影響

2.2 不同濃度SSd作用后TGF-β1誘導的A549細胞EMT相關蛋白的表達

蛋白質印跡結果顯示，不同濃度SSd溶液（0.5，1.0，2.0μmol／L）作用后，TGF-β1（10 ng／mL）刺激的A549細胞E-鈣黏蛋白明顯升高（F＝53.7，P＜0.05），N-鈣黏蛋白（F＝90.22，P＜0.05）、α-SMA（F＝154.01，P＜0.05）、Ⅰ型膠原蛋白（F＝29.88，P＜0.05）表達水平明顯下降。表明SSd可抑制TGF-β1誘導的A549細胞發生EMT，且呈濃度依賴性。見圖2。

同時TGF-β1作用后A549細胞p70S6蛋白、pmTOR表達顯著增強（P＜0.05），表明TGF-β1促進A549細胞EMT發生同時磷酸化激活mTOR。經不同濃度SSd（0.5，1.0，2.0μmol／L）作用后，TGF-β1刺激的A549細胞p70S6（F＝101.44，P＜0.05）、pmTOR蛋白（F＝13.84，P＜0.05）的表達隨SSd濃度的增加而逐漸降低。見圖2。

圖2 不同濃度SSd抑制TGF-β1誘導A549細胞EMT相關蛋白表達

2.3 SSd作用不同時間點TGF-β1誘導的A549細胞EMT相關蛋白的表達

A549細胞經TGF-β1（10 ng／mL）刺激24 h發生EMT，選擇1μmol／L的SSd作用8，12，24 h后，p70S6（F＝24.47，P＜0.05）、mTOR（F＝24.00，P＜0.05）蛋白的表達隨時間變化逐漸降低，表明mTOR磷酸化及其下游信號通路的激活受到抑制；間質化指標α-SMA（F＝19.72，P＜0.05）、Ⅰ型膠原蛋白（F＝49.53，P＜0.05）表達顯著下降，表明SSd同時逆轉了EMT過程（圖3）。

圖3 SSd作用不同時間點TGF-β1誘導的A549細胞EMT相關蛋白的表達

3 討論

人肺腺癌A549細胞屬上皮來源細胞，具有穩定的肺泡上皮細胞的特征，廣泛用于體外Ⅱ型肺上皮細胞藥物代謝的模型。IPF病理特點是Ⅱ型肺泡上皮細胞增生，肌纖維母細胞聚集及肺組織結構重塑。目前認為，IPF是起源于肺泡上皮反復發生微小損傷的異常修復。在損傷修復時肺泡上皮細胞、巨噬細胞異常激活產生多種生長因子和趨化因子誘導固有成纖維細胞增生，趨化循環纖維細胞到肺臟損傷部位，刺激EMT和成纖維細胞分化為肌成纖維細胞［9］。肌成纖維細胞增生分泌大量的細胞外基質（extracellular matrix，ECM），導致纖維瘢痕形成、肺結構破壞、肺功能喪失，促進IPF的進展。在此過程中伴有TGF-β1、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素如IL-8、IL-31、IL-32等多種細胞因子的異常增多，以及TGF-β1／Smads、Wnt／β-catenin等信號通路的異常激活［10］。關于mTOR信號通路的相關研究主要集中在腫瘤領域，mTOR信號通路異常也參與EMT過程［11］。有研究發現PI3K／AKT／mTOR信號通路能調控Snail轉錄因子的表達，誘導EMT的發生［12］。另有研究表明，TGF-β1通過激活PI3K／AKT／mTOR信號通路誘導SPC-A1細胞EMT，從而促進Snail進入細胞核［13］。

阻斷EMT過程是預防、治療IPF的方法之一。IPF的治療除了肺移植外，目前尚缺乏令人滿意的治療藥物。雖然抗纖維化新藥吡啡尼酮已經上市應用［14］，但治療作用及效果還需大規模及長時間的臨床觀察，且費用昂貴。SSd有較強的抗炎、抑制血管生成、抗氧化、抗腫瘤、抗纖維化、誘導細胞凋亡的作用，且毒副作用小、安全性高。

本研究用TGF-β1刺激A549細胞建立EMT模型，其α-SMA表達增加、p-mTOR表達增強，且其下游p70S6蛋白水平也升高。表明A549細胞經TGFβ1刺激發生EMT，同時細胞內mTOR信號通路活化。此外，不同濃度SSd處理后TGF-β1刺激的A549細胞p70S6蛋白表達水平降低，間質細胞特征性指標α-SMA、Ⅰ型膠原蛋白、N-鈣黏蛋白也降低，上皮細胞相關指標E-鈣黏蛋白則升高，呈明顯劑量—時間依賴關系。由此可見，SSd可抑制TGFβ1誘導的A549細胞發生EMT，其機制可能是抑制了mTOR通路的活化，使ECM表達減少。本研究結果為阻止IPF形成，阻斷EMT過程提供了新靶點，也為SSd用于臨床肺纖維化治療提供了理論依據。