橡膠草轉錄組SSR信息分析與標記開發

甘霖 吳景 楊玉雙

摘 要 為了在總RNA水平上揭示橡膠草SSR分布規律和特性，利用GRAMENE網站提供的SSR鑒定工具SSRIT（Simple Sequence Repeat Identification Tool），對橡膠草6 756條無冗余的EST分別進行SSR鑒定。結果共搜查到2 761個1～6堿基SSR，出現頻率最高的為單堿基重復基元類型，其次為三堿基重復基元類型與二堿基重復基元類型，分別為2 139、338與219個，其出現頻率分別為77.5%、12.2%與7.9%。AG/CT為二核苷酸中優勢重復類型，占其總數的73.1%；而AAG/CTT與ACC/GGT則為三核苷酸中優勢重復類型，二者分別占三核苷酸SSR總數的24.3%與23.7%。設計了20對SSR引物并驗證了它們在蒲公英屬3個高度近緣種共24個不同個體中的存在情況。結果表明，引物擴增率為100%，多態率為95%，能夠在DNA水平上將橡膠草（TKs）與其他2個高度近緣種短喙蒲公英（TB）及藥用蒲公英（TO）有效地區分開。由此表明，將所開發的SSR標記用于橡膠草種質鑒定、蒲公英屬不同種間多態性檢測和彼此區分是可行的。

關鍵詞 橡膠草 ；轉錄組 ；SSR ；種質鑒定

中圖分類號 Q756 文獻標識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2019.01.009

Abstract Russian dandelion is an important crop for natural rubber. In this study， simple sequence repeat identification tool was used to screen SSRs in Russian dandelion. A total of 2 761 SSRs were found in 6 756 unique root transcripts. Of the 2 761 SSRs， the most abundant SSR is the mon- nucleotide type， with the SSR numbers being 2 139， followed by the tri- and di- nucleotide ones， with 338 and 219 SSR numbers， accounting for 77.5%，12.2%，and 7.9%， respectively. Among the di-nucleotide repeats， AG/CT was the most motifs and accounted for 73.1%. However，AAG/CTT and ACC/GGT were both the most frequent motif among the tri-nucleotide repeats， accounting for 24.3% and 23.7%，respectively. 20 pairs of SSR primers were designed and tested for the presence of 24 individuals in 3 closely related species of Taraxacum. The results showed that the amplification efficiency was 100%， and the polymorphism efficiency was 95%. It could separate the Taraxacum kok-saghyz （TKs） from the other 2 relatives， Taraxacum brevirostre （TB） and Taraxacum officinale （TO）， at DNA level. These results indicated that the developed SSR markers could be used for germplasm identification of TKs， and it was feasible to detect and differentiate different species between Taraxacum.

Key words russian dandelion ； transcriptome ； SSR ； germplasm identification

橡膠草（Taraxacum kok-saghyz Rodin， TKs）又名俄羅斯蒲公英（Russian dandelion），為菊科蒲公英屬多年生草本植物，根部含有豐富的天然橡膠。原產于哈薩克斯坦、歐洲以及中國新疆等地，野生種質常分布于鹽堿化草甸、河漫灘草甸及農田水渠邊。甘肅、陜西以及東北、華北、西北等地也有分布[1]。橡膠草適應性強、生長收獲期短，適合機械化種植和采收，并且具有較強的抗病蟲、抗寒、抗旱能力以及較好的生物相容性、抗過敏性等優點，成為具有發展前途的巴西橡膠樹橡膠替代作物[2]。另外，橡膠草也是研究植物產膠機理的良好模式植物和生物反應器，其根、葉中可以提取菊糖，提膠后的殘渣可以加工成酒精、沼氣，并且具有一定藥用價值。橡膠草在模式植物研究、工業原料生產和生物質能源轉換等領域均具有較好的發展前景[3]，有助于緩解面臨的能源和戰略原材料短缺問題。由于目前國內對這一資源還缺乏系統的保護，對其遺傳育種方面的研究更是滯后；此外，橡膠草原產地的過度放牧使野生橡膠草資源面臨著滅絕的風險。因此如何快速對野生橡膠草資源進行系統搜集保存，利用現代分子標記技術快速開展育種研究，挖掘其產膠潛能有著十分重要的意義。

SSR分子標記因其具有信息量豐富、多等位性以及共顯性等特點而得到了廣泛應用，目前已成功從多種植物和微生物中開發出了SSR標記。一般而言，物種全基因組測序會受到基因組大小、重復序列及雜合度的影響，加之成本高，這使得短時間內獲得大量序列信息面臨著挑戰。然而Denovo轉錄組測序不依賴于種基因組，能夠快速、廉價地獲得物種全轉錄本序列信息，其中蘊含著大量可用的SSR標記。本文利用已公布的橡膠草75 868條轉錄組數據，從中查找并分析橡膠草SSR序列信息，旨在總RNA水平上揭示橡膠草SSR分布規律和特性，同時為橡膠草遺傳圖譜構建、功能基因的定位和克隆、系譜分析提供實用的分子標記。

1 材料與方法

1.1 材料

從PlantGDB網站（http：//www.plantgdb.org）下載75 868條橡膠草轉錄組數據。SSR擴增用的24份材料采集自中國新疆伊犁地區。

1.2 方法

1.2.1 數據預處理及其SSR位點篩選

利用blast軟件進行比對，相似度≥80%的默認為同一序列，按照此標準進行去冗余拼接獲得Unigene；利用SSRIT在線分析軟件（http：//www.gramene.org/db/searches/ssrtool）對獲得的無冗余Unigene進行SSR鑒定。以重復序列總長≥24 bp作為SSR篩選標準，即單核苷酸，二、三、四、五和六核苷酸的最少重復次數分別在24次、12次、8次、6次、5次、4次以上。

1.2.2 SSR引物設計及多態性分析

對鑒定出的各EST-SSR進行比較，對于含同一個重復基元的多條Unigene，優先選取重復序列長、重復次數多的片段，在重復基元上下游合適的位置設計引物。引物設計原則為： GC含量45%～65%，Tm值55～65℃，引物序列長18～25 bp，且無錯配、無發夾結構等。DNA提取參照天根DNA提取試劑盒方法進行。PCR擴增及多態性分析參照黃海燕等[4]方法進行。

2 結果與分析

2.1 橡膠草EST-SSR類型及頻率分析

對75 868條橡膠草轉錄組序列進行去冗余和組裝拼接，得到6 756條Unigene，總長度為5.13×106 bp。共鑒定到2 761個SSR，分布于2 376條無冗余的EST上，發生頻率為35.2%（含有SSR的EST與無冗余EST數之比），SSR平均分布距離為1.86 kb。其中有323條Unigene包含有1個以上SSR（表1）。在2 761個SSR中，單核苷酸以及二、三、四、五、六核苷酸SSR分別為2 139、219、338、8、11和46個，出現頻率分別為77.5%、7.9%、12.2%、0.3%、0.4%與1.7%（圖1）。其中，二、三核苷酸基元類型分布最為廣泛，以AG/CT基元為最豐富類型；在三核苷酸SSR中共存在10種不同基元類型，其中AAG/CTT與ACC/GGT為主導類型。

2.2 橡膠草EST-SSR多態性預測及引物設計

SSR標記多態性與其基元重復數密切相關[5]，往往重復數越高，其變異概率越大[6-7]，多態性越顯著。多態性是判斷分子標記是否可用的一個重要依據。為了提高引物的多態率，本研究將24 bp以下的低多態潛能SSR過濾掉，保留了重復次數依次為24、12、8、6、5及4次以上的單、二、三、四、五和六核苷酸Unigene。共鑒定到大于24 bp的SSR 303個（表2），占總SSR的11%。分別在303個EST-SSR的上下游合適位置設計引物，推測這些SSR在橡膠草上具有比較豐富的多態性。表3僅列出了其中20對SSR引物。

2.3 引物有效性檢測

為了檢測已設計的20對SSR引物在蒲公英屬不同植株中的存在情況，分別對24份DNA進行擴增和電泳檢測。結果發現20對引物在橡膠草基因組DNA中均能有效擴增（圖2，部分結果），其中具有多態性的19對引物均能擴增出目標條帶，占總引物數的95%。有的引物對甚至能擴出2個及以上的等位基因，如引物對Ts491F/R在橡膠草中能特異擴增出單一目標帶，而在其它材料中存在2個或以上等位基因的情況（圖2-i）。引物對Ts767F/R擴增出來的條帶中存在明顯的大小差異（圖2-c）；引物對Ts451F/R及引物對Ts661F/R擴增出來的條帶大小差異多態明顯（圖2-d，2-g）。可見，基于橡膠草EST-SSR序列所開發的SSR標記在橡膠草植株中能夠較好地擴增，而且能夠在DNA水平上將橡膠草與其他2個近緣種短角蒲公英（TB）及普通蒲公英（TO）進行較好地區分。說明所開發的SSR標記對蒲公英屬進行多態性檢測和篩選是可行的。

3 討論

由于橡膠草與蒲公英屬的其他2個高度近緣種短喙蒲公英（TB）及藥用蒲公英（TO）在形態上極為相似，因此如何快速、準確地鑒定橡膠草資源，挖掘優異種質并及時開展物種保護具有十分重要的意義。傳統的依托植株外形進行品種鑒定或橡膠含量判定的辦法往往存在較大的誤差，可能降低育種以及品種改良的效率。因此，通過SSR標記開發和驗證技術，快速準確地鑒定橡膠草種質，尋找與橡膠含量連鎖的SSR分子標記，開展分子標記輔助（MAS）育種，將是獲得高產橡膠草品系的快捷途徑。

SSR標記已廣泛應用于多物種的遺傳多樣性、連鎖圖譜構建、比較基因組學及關聯分析等領域[8-9]。隨著高通量測序技術的不斷升級以及測序成本不斷降低，越來越多的物種基因組與轉錄組數據被釋放和公布，這為廣覆蓋、高效開發SSR標記提供了快速途徑[10]。本研究對橡膠草的6 756條無冗余Unigene進行了SSR鑒定，共篩選到2 761個1～6堿基SSR，分布在2 376條無冗余的EST上，發生頻率為35.2%。在搜索出來的SSR中，其中出現頻率最高的為單堿基重復基元類型，其次為三堿基重復基元類型與二堿基重復基元類型。SSR平均分布距離為1/1.86 kb，低于安澤偉等[11]此前報道的巴西橡膠樹的EST-SSR數值1/3.93 kb。

在本研究中，二堿基重復基元類型SSR中，共存在AC/GT、AG/CT、AT/AT等3種類型，其中AG/CT為主導類型；而在三堿基重復基元類型中共存在10種不同基序，其中AAG/CTT與ACC/GGT為主導類型，這與巴西橡膠樹EST-SSR類似，其以二堿基和三堿基重復基元為主，分別以AG/TC和CTT/GAA為最多[11]。

為增大后續SSR標記開發的成功率，本研究過濾了多態潛能較低的24 bp以下SSR，最終獲得303個SSR。驗證了20對SSR引物在蒲公英屬不同植株中的存在情況，對24份DNA進行PCR擴增的結果表明，引物均能在橡膠草基因組DNA中有效擴增；而且19對引物均顯示出多態性。如圖2所示，9對引物中的任意一對均能將TKs、TB及TO區分開，這在種質分子鑒定中具有一定的應用價值。本研究所獲得的引物在橡膠草中是否如推測的那樣具有豐富的多態性以及如何獲得能夠精細地將每個個體進行區分的分子標記，如何得到通用性及多態性更好的引物，還需擴大樣本量進行檢測，進一步通過實驗驗證。

參考文獻

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