稻瘟病菌產孢技術和防治方法概述

韓玉 吳堯 王林

摘 要：該文總結了稻瘟病菌的分離方法、適合產孢的培養基、溫度和pH、保存方法以及主要防治技術的研究進展，以期為稻瘟病菌生理小種的鑒定和治病機理的研究提供參考。

關鍵詞：稻瘟病菌；分離方法；保存方法；防治方法

中圖分類號 S435 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2019）07-0057-03

Abstract：According to the research progress，the isolation methods of Magnaporthe oryzae，the medium suitable for sporulation，temperature and pH，the preservation methods，and the main control methods were summarized，in order to lay the foundation for the identification and treatment mechanism of the pHysiological race of Magnaporthe oryzae，and to improve the quality of rice as a reference.

Key words：Magnaporthe oryzae；Separation method；Preservation method；Control method

稻瘟病是水稻主要病害之一，易造成水稻的大面積減產，它是由稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae；無性態為稻梨孢菌：Pyricularia oryzae）引起[1]，產生的孢子通過風、雨水、病殘體等傳播[2]，一旦遇到合適的氣候條件，易大面積暴發，造成嚴重危害。目前，對稻瘟病病菌生理機制的研究需要在室內人工環境中進行培養鑒定。多年來，不同科研工作者對適合稻瘟病菌培養方法及條件等進行了深入研究，得到了大量試驗結果。本文根據文獻報道以及部分結果實驗，對稻瘟病菌產孢技術和防治技術做以下總結概述。

1 稻瘟病菌單孢分離方法

稻瘟病菌分離方法多種多樣，主要有直接挑單孢法、罹病組織分離法、稀釋法等，但運用最多的還是參照高坂淖爾等[3]提出的挑菌法。分離出單一的稻瘟病菌是培養的關鍵，為后期回接鑒定提供了基礎保障。

1.1 挑菌法 裝置的制備：用硬紙制作一個圓形的擱物臺（正好可以套在聚光鏡鏡頭上，直徑2.3cm，高度2.0cm），在擱物臺的上部剪1個小口，可以讓稻節固定。在樣品夾的右部分粘上1塊兩面膠，寬度和長度正好可以將1塊橡皮固定住，將針灸針末端減去后插在橡皮中部，整個挑菌裝置制作完成。具體操作：將采集的病稻節用自來水沖洗干凈，然后置于鋪有濕潤無菌濾紙的培養皿中保濕培養2d左右。將病稻節放在制作的擱物臺上，先移動載物臺使接種針移到視野中央，通過細準焦螺旋使接種針清晰成像，然后將針灸針移到視野外；接著再用調節旋鈕上下調整使稻節上的孢子在目鏡中能清晰成像，此時將針灸針慢慢靠近病稻節，在目鏡下挑取單孢。最后用接種針取一小塊固體培養基蘸取單孢，置于平板中央培養。這種操作過程需在超凈工作臺中完成。這種方法分離單孢精確，但是操作難度大，需要技巧和熟練，分離效率50%～70%。

1.2 罹病組織分離法[4] 將采集的病稻節先用75%酒精消毒30s后，用自來水沖洗干凈，然后按照挑菌法一樣保濕培養。培養完成后的病稻節上面產生大量孢子，用無菌鑷子夾取病稻節，然后在培養基平板上輕敲3～4下，此時解剖鏡下觀察單孢的有無及數量。這種分離方法操作簡單，但是產生的單孢可能不是同一生理小種，不能分離出純稻瘟病菌株，對后期的實驗結果影響很大。而且這種方法在敲落孢子的過程中污染幾率大。

2 稻瘟病菌分離培養基

適合稻瘟病菌生長和產孢的培養基種類豐富，其組成成分也千差萬別。在生理小種鑒別試驗中，前期需要在實驗室培養中篩選合適的培養基使病菌產孢量豐富，而產孢量低且存在其他問題的培養基會被淘汰，篩選最優的產孢培養基是實驗的關鍵。幾十年來，不同的研究者報道了許多適合稻瘟病產孢的培養基。

2.1 馬鈴薯蔗糖培養基[5] 取200g馬鈴薯加水煮沸30min，用紗布過濾，補水至1000mL，然后加20g蔗糖攪拌均勻，平板培養基再加1%瓊脂。這種方法制作方便，成本低廉，產孢量相對適中，實際工作中應用較為廣泛。

2.2 番茄燕麥培養基[6] 稱取燕麥片40g在水中煮沸10min，用雙層紗布過濾，番茄汁150mL，將2種汁液混合，再加水定容到1L，平板培養基再加1%瓊脂。這種方法產孢量合適，一般都能達到相應的產孢量，而且成本低，是較為合適的培養基之一。

2.3 米糠培養基[7] 米糠50g在水中煮沸30min，用雙層紗布過濾，加入蔗糖25g，再加水定容到1L，平板培養基再加1%瓊脂。這種方法較為經典，但是米糠含氮量低，其他營養價值也不高，所以產孢量低。根據許鳴一的研究報道，經改良的3×米糠培養基使產孢量增加，但也存在因透明度低不適合觀察等缺點。

2.4 稻桿煎汁V8培養基[3] 將50g稻桿煮沸加水補充至750mL，V8液汁250mL，CaCO3 3g，瓊脂10g。這種方法產孢量優于米糠培養基，但經濟成本較高，實際生產中不適合使用。

2.5 稻秸浸出液+PDA培養基（1∶1）[8] 稻秸浸出液：稱取剪碎的稻秸30g，用1000mL清水浸泡16～24h；PDA培養基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂18g，清水1000mL。這種方法在經濟成本和來源難易程度上優于番茄燕麥培養基，但是制作起來相對復雜一些。在實驗過程中，選擇什么樣的培養基供稻瘟病菌生長和產孢，還應根據實驗需要以及材料的方便可取性。

3 稻瘟病菌適宜溫度和pH

根據文獻報道，28℃最適合稻瘟病菌的生長和產孢，其中16℃下雖能產孢，但病菌生長明顯滯后，這可能是由于溫度低限制了病菌生長所需的酶活性[9]，但后期恢復28℃，病菌仍能正常產孢。23℃產孢量少于28℃，但多于33℃。38℃病菌無法正常生長，但未完全失去活性[10]。

不同菌株對不同pH的變化反應存在一定的差異，但是在pH5～7的范圍內，菌株的生長速率基本不受影響，但就生長狀況而言，pH5時病菌生長狀況良好[10]。

4 稻瘟病菌保存方法

稻瘟病菌的保存過程至關重要，若保存不佳，容易出現雜菌污染、病菌失去活性等狀況，因此選擇合適的保存方法是整個實驗的重中之重。

4.1 濾紙片保存法[11] 將分離的菌株接種在平鋪有10張1cm×1cm無菌濾紙片的平板培養基上，待菌株長滿濾紙片，用鑷子夾取濾紙片放入無菌離心管中，干燥處理，待濾紙片完全干燥后將離心管蓋上蓋子放入-20℃冰箱中保存。這種方法操作簡單，不易造成污染，保存方便。

4.2 稻草節保存法 將稻節用粉碎機粉碎（粉碎成絲狀而非粉末狀的程度），置于滅菌鍋中121℃、45min滅菌，而后將其平鋪在平板培養基上，接種稻瘟病菌，待病菌長滿培養皿，將稻節轉移至離心管中，干燥處理后于-20℃冰箱中保存。這種方法的材料來源雖是病菌的寄主植物，但是后期培養易造成污染，稻節含有其他雜菌，保存難度大。

4.3 高粱粒保存法[11] 高粱粒在121℃、45min滅菌后烘干，取10粒平放在平板培養皿中部，接種稻瘟病菌，直至病菌長滿高粱粒，然后將高粱粒轉入離心管中，干燥后蓋上蓋子保存在-20℃冰箱中。這種方法容易造成其他雜菌的滋生，占用空間大。

5 稻瘟病防治技術

在稻瘟病易發區，其預防和防治工作每年必不可少，做好預報和預警以及防控，可以大大降低稻瘟病發生帶來的風險。

5.1 積極宣傳，加強農戶的防范意識[12] 在水稻種植區，要經常培訓，發放植保有關資料，提高農民的防范意識和技術水平，一旦發現病情要及時上報，將風險降到最低。

5.2 選用抗病品種[13] 隨著抗稻瘟病品種的普及與推廣，種植抗病品種是最佳選擇。但是應杜絕長時間種植單一品種，使優勢生理小種大面積擴散，造成不可挽回的損失，所以要搭配使用抗病品種。

5.3 加強水肥管理[14] 在水稻種植前期，及時清理雜草、病稻節等，在水稻生長期，合理施肥，多施農家肥，避免施單一肥；合理灌溉，確保水稻生長。

5.4 化學防治[15] 在稻瘟病發生的情況下，及時選擇合適的藥劑進行噴藥防治，并避免使用單一藥劑，延緩抗藥性的產生。藥劑防治要避開水稻揚花期。

5.5 生物防治 隨著科學技術的進步，利用生物技術防治稻瘟病已屢見不鮮。研究表明，芽孢桿菌對防治稻瘟病中具有重要的作用[16]；布氏白僵菌對稻瘟病菌防治具有一定的抑制作用[17]；解淀粉芽孢桿菌發酵濾液能明顯抑制稻瘟病菌菌絲生長和孢子萌發[18]；瑞香狼毒乙酸乙酯萃取物對稻瘟病菌有較強的抑制作用，它能抑制菌絲生長、孢子萌發和生長[19]；黃綠木霉菌發酵液對稻瘟病菌有抑菌和致菌死亡的作用[20]；灰黃霉素對稻瘟病菌的抑制效果與其濃度成正比[21]等。在生物防治稻瘟病的研究方面已經取得一定的進展，但是在實際生產應用中還有待加強和推廣。

6 小結與展望

水稻是我國最主要的糧食作物之一，但稻瘟病菌每年都會對其造成嚴重危害。稻瘟病菌生理小種繁多且易變異對其研究需先了解其產孢特點及生物學特性，掌握治病機理。在此基礎上，堅持綠色防治理念，通過科學的方法降低稻瘟病的發生幾率，確保水稻生產安全。

參考文獻

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（責編：張宏民）