高效液相色譜法測定葡萄制品中的白藜蘆醇

鐘永紅，蘇流坤，劉 敏，宋玉梅，黃子榮，梁家佑，溫才潔

(1.中國廣州分析測試中心，廣東 廣州 510070；2.廣東省分析測試技術公共實驗室，廣東 廣州 510070)

白藜蘆醇(Resveratrol)是一種植物抗毒素多酚化合物，是植物為了抵御外界病菌入侵而產生的抗毒型物質[1]。研究表明，白藜蘆醇具有抗氧化、保肝、抗炎、免疫刺激、調節脂質代謝等多種生物活性及免疫調節作用[2-3]，能抑制血小板聚集，減少心臟病的發生和控制其發展；還有抗菌、抗衰老等作用[4-5]。白藜蘆醇存在于多種植物中，例如：葡萄、花生、桑植等[6]，其中，葡萄中白藜蘆醇的含量最高[7]，常作為白藜蘆醇提取的主要原料。由于葡萄制品天然富含白藜蘆醇，因此可作為人們補充白藜蘆醇的首選佳品。市售的葡萄制品種類很多，主要有葡萄酒、飲品、粉劑和膠囊等。由于葡萄制品中白藜蘆醇的含量參差不齊，所以建立葡萄制品中白藜蘆醇的測定方法很有必要。

目前，白藜蘆醇的檢測方法主要有紫外分光光度法、熒光光度法、薄層色譜法、毛細管電泳法、氣相色譜法和高效液相色譜法等[4,8]。高效液相色譜法具有分離效率快、靈敏度高、適用于熱不穩定化合物等優點。本文參照相關標準方法[9]，建立了HPLC法測定葡萄及其制品中白藜蘆醇含量的方法，可為相關監管部門提供方法參考。

1 實驗部分

1.1 實驗儀器

高效液相色譜儀-二極管陣列檢測器(LC-20A 2300，日本島津公司)，超聲波清洗器(KQ-220型，昆山市超聲儀器有限公司)，電子天平(BT125D，Sartorius)，漩渦混合器(XW-80A型，上海琪特分析儀器有限公司)，KL512型氮吹儀(北京康林科技有限責任公司)，旋轉蒸發儀(YRE-201D，鞏義市予華儀器有限責任公司)。

1.2 標準品與試劑

白藜蘆醇(99.5%，中國藥品生物制品檢定所)；甲醇、乙腈(色譜純，Merck)；乙酸乙酯、無水乙醇、氯化鈉、無水硫酸鈉(分析純，廣州化學試劑廠)；蒸餾水(自制)。

1.3 溶液配制

標準儲備液：準確稱取0.01256 g白藜蘆醇于25 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，濃度為500 mg/L，此溶液現配現用。

標準工作液：從標準儲備液逐級稀釋，用甲醇定容，配置成濃度為0.5、1.0、5.0、25、50 mg/L的系列標準工作液。

1.4 樣品前處理

葡萄酒：稱取20.0 g試樣，加2.0 g氯化鈉溶解后，再加25.0 mL乙酸乙酯振蕩萃取，分出乙酸乙酯過無水硫酸鈉，重復一次，合并萃取液后，采用旋轉蒸發儀50℃旋轉蒸至近干，用甲醇定容至5.0 mL[10]。

葡萄飲品：搖勻后取樣，準確稱取1.0～10.0 g樣品于50 mL聚丙烯刻度離心管中，用甲醇定容至50 mL，超聲提取10 min后，過濾上機。

葡萄皮粉試樣：稱取0.05～0.1 g樣品于100 mL容量瓶中，加入甲醇80 mL，用旋渦混合儀混勻2 min后，超聲提取20 min，過濾上機。

膠囊試樣：取20粒膠囊內容物，混勻；稱取0.2～0.4 g樣品于100 mL容量瓶中，加入甲醇80 mL，用旋渦混合儀混勻2 min后，超聲提取20 min，冷卻后定容，過濾上機[9,11]。

1.5 色譜條件

色譜柱：Agilent C18(4.6 mm×25 0 mm，5 μm)；流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL；柱溫：35℃；檢測波長：306 nm；流動相：乙腈/水=30/70。

2 結果與討論

2.1 檢測波長的選擇

本實驗選用的高效液相色譜儀配備的檢測器是光電二極管陣列檢測器，采用光電二極管陣列檢測器在190～800 nm波長范圍對白藜蘆醇進行光譜掃描，得出白藜蘆醇的最大吸收波長為306 nm，因此檢測波長選為306 nm。

2.2 線性范圍和檢出限

用甲醇將標準儲備液進行逐級稀釋，配置成濃度分別為0.5、1.0、5.0、25.0、50.0 mg/L的系列標準工作液。以白藜蘆醇的色譜峰面積為縱坐標(Y)，標準濃度為橫坐標(X)，求得線性方程為Y = 7049X-11382，線性相關系數(R)為0.9999。結果表明在0.5～50.0 mg/L范圍內，白藜蘆醇線性良好，檢出限為0.5 mg/kg(信噪比，S/N = 3)。

2.3 加標回收率和相對標準偏差

分別稱取葡萄復合飲品、葡萄粉和白藜蘆醇膠囊各8份，其中6份按照“1.4”進行樣品前處理，計算方法的相對標準偏差，具體結果見表1；剩余2份做加標回收，根據樣品中白藜蘆醇的含量不同，加入適量的標準溶液。前處理方法參照“1.4”，求得加標回收率結果見表1。

表1 白藜蘆醇的加標回收率和相對標準偏差

2.4 日內與日間精密度

選定濃度為25.0 mg/L的標準溶液，重復進樣6次，得出白藜蘆醇峰面積的相對標準偏差為2.6%，表明具有良好的日內精密度。連續5天將上述濾液進行上機測定，得出白藜蘆醇峰面積的相對標準偏差為4.3%，表明具有良好的日間精密度。

2.5 實際樣品測定

樣品前處理按照“1.4”制備后，按照“1.5”進行上機測定，得到的標準品和樣品色譜圖見圖1，實際樣品測定結果見表2。

通過對20類樣品，206個樣品進行含量測定，結果表明：同一類別葡萄制品中白藜蘆醇的含量參差不齊，例如：對于測定的8個不同品牌的葡萄復合飲品，5個檢測結果為未檢出，其它3個樣品含量分別為0.152、0.178和0.305 mg/100g。所以，消費者想要選擇含有白藜蘆醇的相關產品時，不僅要看標簽標示值，還需要做進一步確認。20種樣品的檢測結果見表2。

表2 20種樣品的測定結果

圖1 白藜蘆醇標準品和3種葡萄制品色譜圖

Fig.1 The chromatogram of resveratrol standard and three grape products

3 結論

本研究建立了不同類別葡萄制品中白藜蘆醇的高效液相色譜分析方法，并對206個樣品進行含量測定，白藜蘆醇在0.50～50 mg/L范圍內呈良好線性，檢出限為0.5 mg/kg。結果表明該方法適用范圍廣、重現性好和準確度高，可為相關監管部門提供方法參考。