黑豆皮紅色素的不同提取方法對抗氧化性的影響

明倩伊，張海容

(1.山西醫科大學 影像學系，山西 太原 030001；2.忻州師范學院 生化分析技術研究所，山西 忻州 034000)

黑豆是豆科大豆屬植物大豆的黑色種子，營養豐富，必需氨基酸齊全、比例合適，不僅具有營養價值而且具有保健功能，被國家衛生部列為“既是食品又是藥品的農產品”。而且隨著分析技術和毒理學的不斷發展，人們發現大部分合成色素對人體有致癌作用，因此黑豆作為一種新型的天然色素源也得到了重視[1]。黑豆皮紅色素[2-5]為花色苷類色素， 包括矢車菊素-3-葡萄糖苷、飛燕草素-3-葡萄糖苷和矢車菊素-3-半乳糖苷。現已證實其主要著色成分為矢車菊素-3-乳糖苷，分子式為C21H21O11，相對分子質量為449.39，分子結構如圖1。如果R=葡萄糖，R1=H 時為矢車菊素-3-葡萄糖苷，R1=OH 時為飛燕草素-3-葡萄糖苷； 如果R=半乳糖、R1=H 時為矢車菊素-3-半乳糖苷。

圖1 黑豆皮色素的化學結構

據文獻報道，黑豆皮紅色素具有清除羥基自由基、抗氧化、延緩衰老等重要的生理活性，本文對比研究了微波提取、超聲波提取、索氏提取三種不同提取方法對黑豆皮紅色素的抗氧化性，為深入研究與開發天然紅色素提供實驗依據。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

主要試劑：無水乙醇，分析純，天津風船化學試劑科技有限公司；硫酸亞鐵銨，化學純，北京化學試劑三廠；30%過氧化氫，分析純，天津市北辰方正試劑廠；焦性沒食子酸，化學純，貴州遵義市第二化工廠；水楊酸，分析純，天津風船化學試劑科技有限公司；其余試劑皆分析純。

主要儀器: AL204電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海有限公司)DRT-YW型電熱套，鞏義市予華儀器有限責任公司；YXJ-2A離心機，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；SHZ-D循環水式真空泵，鞏義市予華儀器有限責任公司；可見分光光度計，上海光譜SP-723；LG微波，天津樂金電子電器有限公司；KQ-100-DB 型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 索氏浸提取法

實驗通過對黑豆的脫皮、提取溶劑的類型、濃度、料液比及浸提溫度、次數、pH值進行工藝參數的正交試驗，確定最佳提取方法和提取條件為：50%的乙醇水溶液作為浸提液，溫度為70 ℃，料液比為1∶100(g/mL)，時間90 min，pH值=1的條件下提取兩次。

1.2.2 微波輔助提取法

通過正交試驗確定了最佳工藝條件：以0.1 mol/L 鹽酸-75 %乙醇(體積分數為1∶1)為提取劑，微波功率385 W、料液比1∶40、時間120 s、提取2 次。

1.2.3 超聲波輔助提取法

通過正交試驗法對影響色素提取效果的幾個主要因素，即超聲功率、溫度、時間、pH值和液固比進行了優化，結果表明： 在原料用量0.5 g時，以60%乙醇(pH值1.5)為提取溶劑，50 ℃水浴提取60 min，超聲功率80 W、液固比30 mL/g，色素的提取率較高。

1.2.4 自由基清除率的測定方法[6-8]

1.2.4.1 DPPH法

原理：DPPH·是一個大分子的穩定自由基抗氧化劑預期作用模式為：AH + DPPH·→ DPPH-H + A。取提取液1 mL稀釋到50 mL的容量瓶，然后吸取一定量稀釋液，然后加2 mL 2×10-4mol/L 的DPPH·溶液到10 mL比色管中，搖勻，最后用蒸餾水定容到10 mL，30 min 后用提取液作參比，測定樣品吸光度，測定2 mL 2×10-4mol/L DPPH·液定容到10 mL后的吸光度(A對照)，DPPH法根據下面的公式計算清除率：

式中：A參比為加蒸餾水時的吸光度；

A對照為加入DPPH·體系的吸光度；

A樣參為加入不同提取液與蒸餾水后的吸光度；

A樣品為加入不同提取液后DPPH·體系的吸光度。

1.2.4.2 水楊酸法

在10 mL 比色管中依次加入不同體積提取液，7.5 ×10-3mol/L 的硫酸亞鐵銨1 mL，0.3% 的H2O27.5 mol/L 的水楊酸各1 mL，并定容至10 mL，30 min 后，用提取液作參比，測其在510 nm 處的吸光度。水楊酸法清除率計算公式為：

式中：A參比為加入Fe2+、H2O2時的吸光度；

A沒對照為加入Fe2+、H2O2水楊酸后的羥自由基體系的吸光度；

A樣參為加入Fe2+、H2O2不同提取液后的吸光度值；

A樣品為加入Fe2+、H2O2不同提取液、水楊酸后的羥自由基體系的吸光度。

1.2.4.3 鄰苯三酚法

分別取干凈的10 mL比色管，依次加入不同體積提取液，2 mL pH值8.43的緩沖溶液，NBT 2.5 mL，再加1 mL鄰苯三酚，搖勻，20min后，在波長560 nm處測其吸光度。

O2-·清除率計算公式為：

式中： A參比為加入鄰苯三酚、緩沖溶液的吸光度；

A對照為加入鄰苯三酚、緩沖溶液、NBT的吸光度；

A樣參為加入鄰苯三酚、緩沖溶液、提取液的吸光度；

A樣品為加入鄰苯三酚、緩沖溶液、提取液、NBT的吸光度。

3 三種不同提取方法提取黑豆皮色素的抗氧化性測定

表1 不同方法對微波、超聲以及索氏法提取物抗氧化性比較

注：表中y為清除率；x為不同方法提取液體積。

由實驗結果可知：采用DPPH法測定黑豆皮紅色素抗氧化性，微波輔助提取物、超聲波輔助提取物、索氏提取物的清除率都是隨著體積的增加而增大；取相同體積的提取液時，微波輔助提取液的清除率最高，超聲輔助提取液次之，索氏提取液清除率最低。同時當清除率達到70%時微波輔助提取物需0.563 mL，超聲波提取物需0.851 mL，索氏提取物需1.454 mL，提取物的抗氧化能力順序為：微波法>超聲法>索氏提取法，微波輔助提取法黑豆皮色素提取物對DPPH自由基有較強的抗氧化性。

采用水楊酸法測黑豆皮紅色素對·OH自由基的清除率，超聲波輔助提取液的效果最佳，只需要2.885 mL清除率就可達到70%，微波輔助提取液需4.491 mL，索氏提取液需8.577 mL。提取物的抗氧化能力順序為：超聲法>微波法>索氏提取法，超聲法提取物黑豆皮色素對·OH自由基有較強的抗氧化性。

采用鄰苯三酚法測黑豆皮紅色素對超氧陰離子O2-·的清除率，取相同體積的提取液，索氏提取法的清除率最高，當清除率達70%時，索氏提取液需0.117 mL，超聲波輔助提取液需0.203 mL，微波輔助提取液需0.96 mL。提取物的抗氧化能力順序為：索氏提取法>超聲法>微波法，索氏提取法提取物黑豆皮色素對超氧陰離子O2-·有較強的抗氧化性。

研究表明:黑豆皮紅色素具有一定的抗氧化性，對提高人體免疫、保護人類健康有極其重要的生理功能。由于不同提取方法對黑豆皮細胞結構的破壞程度不同，提取液中抗氧化活性成分的含量存在差別，導致不同方法的提取液對自由基的清除率不同。研究結果表明，微波提取液對DPPH自由基的清除率最高，采用水楊酸法清除·OH自由基時超聲輔助提取液的清除效果最佳，但采用鄰苯三酚法清除超氧負離子時索氏提取法清除率最高。實驗結果對藥品、化妝品、食品的研究與開發有重要的參考價值。