以氯化血紅素作為指示劑的Hg2+電化學(xué)傳感器的制備與應(yīng)用

陳碧嬌，李曉燕，牛燕燕，謝 慧，羅貴鈴，習(xí)亞茹，熊 懿，孫 偉

(海南師范大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院 ?？谑泄δ懿牧吓c光電化學(xué)重點實驗室，海南 ?？?571158)

汞是一種有毒元素，易被皮膚和呼吸道吸收，嚴(yán)重危害人體健康[1-2]。近年來隨著工業(yè)的發(fā)展，汞污染日趨嚴(yán)重[3-4]，因此對快速精準(zhǔn)檢測Hg2+的方法提出了更高的要求。適配體能與相應(yīng)的靶分子進(jìn)行高親和力和強(qiáng)特異性的結(jié)合，被稱為“化學(xué)抗體”，具有靶分子范圍廣、易化學(xué)合成、便于修飾及穩(wěn)定性好等優(yōu)勢[5]。氯化血紅素(hemin)是一種天然的金屬鐵卟啉化合物[6]，具有較強(qiáng)的吸附能力，可作為電活性分子，生物催化劑等。

圖1 適配體傳感器的實驗原理示意圖

Fig.1 Schematic diagram of experimental principle of aptamer sensor

本文將hemin作為指示劑構(gòu)建一種可檢測Hg2+的電化學(xué)適配體傳感器。圖1為該電化學(xué)傳感器的工作原理示意圖，將氮摻雜石墨烯(NG)通過滴涂法得到NG/CILE，再將納米金(AuNPs)通過電沉積法[7-9]在NG/CILE表面沉積得到AuNPs/NG/CILE，通過自組裝法[10]將適配體(aptamer)修飾在AuNPs/NG/CILE表面，制得aptamer/AuNPs/NG/CILE。將制得的aptamer/AuNPs/NG/CILE經(jīng)硫代乙醇酸(TGA)處理后保持aptamer鏈處于直立狀態(tài)。在沒有Hg2+的情況下垂直平行的aptamer鏈能夠有效防止hemin吸附到電極表面，而Hg2+存在時，堿基胸腺嘧啶(T)與Hg2+特異性結(jié)合可改變aptamer的排列形式，形成多孔結(jié)構(gòu)[11]。Hemin可以通過這些孔隙吸附在修飾電極表面，其電活性中心Fe(Ⅲ)與電極表面之間會發(fā)生電子轉(zhuǎn)移而產(chǎn)生電信號。采用循環(huán)伏安法(CV)和差分脈沖伏安法(DPV)研究該傳感器對Hg2+的測定，結(jié)果表明其具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、微型化等優(yōu)點。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

CHI1210A型電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司)，三電極系統(tǒng)：以修飾電極為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，鉑絲電極為輔助電極。

氯化血紅素(hemin，合肥博美生物科技有限責(zé)任公司)，硫代乙醇酸(TGA，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，三羥甲基氨基甲烷(Tris，山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司)，氮摻雜石墨烯(NG，南京先豐納米材料有限公司)，硝酸汞(Hg(NO3)2，廣州化學(xué)試劑廠)，氯金酸(HAuCl4，天津凱瑪生化有限公司)，N-己基吡啶六氟磷酸鹽(HPPF6，蘭州雨陸精細(xì)化工有限公司)，適配體序列為：5'-SH-C6-TTT-TTT-TTT-TT-3'(上海生工生物工程有限公司)，其他試劑均為分析純，實驗用水均為二次蒸餾水。

1.2 電化學(xué)適配體傳感器的制備

離子液體修飾碳糊電極(CILE)的制備方法見文獻(xiàn)[12]。

取8 μL NG溶液(0.5 mg/mL)均勻涂布在CILE表面自然晾干后，在2.0 mmol/L HAuCl4和0.5 mol/L KNO3的混合溶液中進(jìn)行恒電位沉積實驗，沉積電位為-0.3 V，沉積時間為300 s，靜置100 s后取出電極輕洗，自然晾干得到AuNPs/NG/CILE。將AuNPs/NG/CILE置于4 ℃條件下于適配體溶液(2 μmol/L)中自組裝60 min后，表面清洗后再用0.1 mmol/LTGA浸泡后即可得到aptamer/AuNPs/NG/CILE。

2 結(jié)果與討論

2.1 適配體傳感器中hemin的循環(huán)伏安圖

適配體修飾電極在含有5 μmol/L hemin的二甲基亞砜(DMSO)[11]溶液中浸泡60 min后在10 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH值=7.4)進(jìn)行循環(huán)伏安測試，如圖2A所示，無Hg2+存在時可觀察到弱的還原峰；含有5 μmol/L Hg2+時出現(xiàn)明顯的還原峰(曲線b)。對照實驗為適配體修飾電極在不含hemin的DMSO溶液中處理后，在10 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH值=7.4)中的循環(huán)伏安圖(如圖2B)。顯然，在沒有Hg2+(曲線a)和有Hg2+(曲線b)的情況下均沒有觀察到明顯的氧化還原峰。結(jié)果表明Hg2+的存在可增強(qiáng)hemin在電極界面的吸附作用，從而增大電化學(xué)檢測信號。

(A)有hemin對適配體修飾電極；(B)無hemin對適配體修飾電極

a-b：Hg2+/aptamer/AuNPs/CILE,Hg2+/aptamer/AuNPs/NG/CILE

利用循環(huán)伏安法(CV)對修飾了NG的適配體傳感器進(jìn)行電化學(xué)行為研究(如圖3)。Hg2+/aptamer/AuNPs/CILE(曲線a)上出現(xiàn)了還原峰，其電流值為26.49 μA；修飾NG后，Hg2+/aptamer/AuNPs/NG/CILE(曲線b)的還原峰電流明顯增大為37.13 μA，高比表面積NG能夠提高aptamer在電極表面上的負(fù)載量，有效地加快電子轉(zhuǎn)移速率，從而提高導(dǎo)電速率。

2.2 實驗條件的優(yōu)化

采用自組裝法將適配體序列固定在修飾電極表面上，自組裝時間是影響適配體傳感性能的重要因素。自組裝時間對電化學(xué)信號的影響如圖4所示。當(dāng)自組裝時間從20 min向60 min變化時，隨著組裝時間的增加，峰電流逐漸增加；當(dāng)組裝時間在60 min到120 min之間，峰電流開始下降，因此選擇最佳的自組裝時間為60 min。

a-f: 20 min，40 min，60 min，80 min，100 min，120 min

圖4 (A)不同組裝時間下，Hg2+/aptamer/AuNPs/NG/CILE在Tris-HCl(pH值=7.4)

混合溶液中的循環(huán)伏安圖;(B)不同組裝時間與峰電流的關(guān)系曲線

Fig.4 (A)Cyclic voltammograms of Hg2+/aptamer/AuNPs/NG/CILE in Tris-HCl (pH=7.4) solution with different assembly times;(B)Relationship of different self-assembly time and the peak current

2.3 工作曲線

在10 mmol/L Tris-HCl (pH值7.4)緩沖液中采用DPV研究不同濃度Hg2+溶液(含2 μmol/L hemin)對aptamer/AuNPs/NG/CILE電化學(xué)行為的影響，結(jié)果如圖5A所示。隨著Hg2+濃度的增加，峰電流值也逐漸增大，這是由于Hg2+濃度的增大使電極表面形成的T-Hg2+-T數(shù)量增加，適配體膜的孔隙增多，從而導(dǎo)致hemin在電極界面的吸附量增大，峰電流值也隨之增大。還原峰電流(Ipc)與Hg2+濃度的對數(shù)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(如圖5B)，線性回歸方程為Ipc(μA)=6.115+48.021 lg C(mol/L) (γ=0.995)，檢測限為1.67×10-8mol/L (3σ)，線性范圍為5.0×10-8～5.0×10-6mol/L。

a-f: 5.0×10-8,1.0×10-7,5.0×10-7,1.0×10-6,2.0×10-6,5.0×10-6mol/L

圖5 (A)不同濃度Hg2+在aptamer/AuNPs/NG/CILE上的DPV曲線;(B)Hg2+濃度的對數(shù)與峰電流值的線性關(guān)系曲線

Fig.5 (A)DPV of Hg2+detection on aptamer/AuNPs/NG/CILE;(B)Linear relationship between logarithm of Hg2+concentration and the peak current value

2.4 干擾測定

探究其他非特異性金屬離子(如濃度均為1 mmol/L Na+、K+、Co2+、Cd2+和Ba2+)對本實驗所制備的Hg2+電化學(xué)適配體傳感器的干擾實驗。通過對比實驗結(jié)果(圖6)，發(fā)現(xiàn)非特異性的金屬離子對該適配體傳感器的干擾很小，這是由于本方法所采用的適配體只能與Hg2+發(fā)生特異性結(jié)合而不和其它金屬離子發(fā)生相互作用，因此該修飾電極對Hg2+具有較好的特異性識別能力。

圖6 Hg2+和干擾離子(Na+、K+、Co2+、Cd2+和Ba2+)

3 結(jié)論

本文研究了一種以hemin作為指示劑的Hg2+電化學(xué)適配體傳感器。Hg2+存在時，胸腺嘧啶T堿基與Hg2+的特異性結(jié)合可改變aptamer的排列形式，使其形成多孔結(jié)構(gòu)。此時，hemin可以通過這些孔隙吸附在修飾電極表面產(chǎn)生電化學(xué)信號。將所構(gòu)建的適配體傳感器應(yīng)用于微量Hg2+的檢測，具有良好的應(yīng)用前景。