鎖陽原花青素對葡萄糖/甘氨酸模擬體系糖基化終產物的抑制效果

張喜峰，徐 瑩，尚 琪，馬銀山，陳雨迪，羅光宏

1河西學院農業與生物技術學院；2甘肅省河西走廊特色資源利用重點實驗室，張掖 734000；3渭南市產品質量監督檢驗所，渭南 714000；4河西學院凱源生物技術開發中心，張掖 734000

晚期糖基化終末產物 (advanced glycation end products，AGEs)是指核酸、脂肪酸、蛋白質或氨基酸的氨基與還原糖的醛基之間發生重排、脫水、氧化、縮合等一系列非酶促性反應 (又稱 Maillard反應)，最終形成具有活性的不可逆化合物[1]。在食品加工、加熱和貯藏過程中，Maillard反應可以提高食品風味和色澤；然而，含AGEs食物的過量攝入和機體內產生過量的AGEs均會導致多種慢性疾病，如糖尿病[2]、腎臟疾病[3]、阿爾茨海默病(AD)[4]、衰老等[5]。

近年來，抗糖基化一直被認為是一種有效的策略來減緩人的衰老和疾病的發生。糖基化的抑制作用可以抑制炎性激活，減少炎癥反應[6,7]。國內外學者普遍認為[8-10]，抗氧化劑對AGEs的生成具有良好的抑制效果；另外，食物中的成分、加工方式、加熱溫度、加熱時間等均可影響AGEs的形成[11]。原花青素(proanthocyanidins，PC)是植物中廣泛存在的一大類多酚化合物的總稱，其抗糖基化、抗氧化和抗炎癥的能力已被廣泛研究[12]。

鎖陽(CynomoriumsongaricumRupr.)，為鎖陽科、鎖陽屬多年生肉質寄生草本，國內主要分布于新疆、甘肅、內蒙、寧夏等地；國內外研究學者主要對鎖陽中多糖、皂苷、黃酮、原花青素等活性成分及其生物學活性進行了一系列研究[13-16]；鎖陽原花青素研究主要集中于單體分離和動物相關試驗，其作為AGEs抑制劑在食品加工應用中的相關報道較少。目前，已有其他類型原花青素提取物對模擬體系中AGEs抑制作用的相關報道，如黎超等人[17]研究表明肉桂原花青素對高級糖基化終產物抑制活性高于陽性對照；吳茜等[18]研究表明一定濃度范圍內蓮原花青素對乳糖-賴氨酸體系中晚期糖基化終產物具有一定抑制作用；荔枝皮原花青素在不同模擬體系中均對美拉德反應和晚期糖基化終末產物具有良好的抑制效果[19]。

因此，本試驗將原花青素加入可產生甜香型風味物質葡萄糖/甘氨酸模擬體系，研究其對模擬體系發生Maillard反應抑制效果，分別研究不同溫度、反應時間、金屬離子種類和濃度等參數，分析鎖陽原花青素對體系中形成AGEs的抑制效果，為天然活性成分深度開發和在食品加工領域的應用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

鎖陽(CynomoriumsongaricumRupr)由甘肅微藻工程技術研究中心提供。

Ca2+、Zn2+、Fe2+、Mg2+、Cu2+、Al3+標準溶液及兒茶素標準品購自成都德思特生物技術有限公司；L-甘氨酸、α-D-葡萄糖購于上海源葉生物科技有限公司；其它試劑均為分析純，購自北京索萊寶科技有限公司。

AE124電子天平，上海恒平科學儀器有限公司；JPT-10型架盤天平，常熟市衡器廠；DD-5M立式大容量離心機，湖南凱達科學儀器有限公司；XO-SM50超聲波微波組合反應系統，南京先歐生物科技有限公司；JRA-6數顯磁力攪拌水浴鍋，金壇市杰瑞爾電器有限公司；F-7000熒光分光光度計，日立高新技術公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 鎖陽原花青素的制備

稱取一定量的鎖陽粉末，按照料液比1∶8 (g/mL)加入體積分數為80%的乙醇，在40 ℃水浴攪拌30 min，在功率為100 W條件下，超聲處理10 min；4 000 rpm離心10 min后，收集上清液；將離心后殘渣按照上述步驟重復提取1次后，上清液經減壓濃縮后，采用大孔樹脂XAD-7分離純化，采用體積分數為60%乙醇洗脫、濃縮、冷凍干燥后，得鎖陽原花青素提取物，經香草醛-濃鹽酸法測其質量分數為90%以上。

1.2.2 不同反應時間下，鎖陽原花青素對葡萄糖/甘氨酸模擬體系中AGEs抑制作用的影響

參考夏秋琴之法[20]，略作改動；在葡萄糖/甘氨酸模擬體系中，加入質量濃度為1 mg/mL的鎖陽原花青素1 mL，充分混勻。在溫度為80 ℃條件下分別加熱反應15、30、45、60、75、90、105 min；在溫度為100 ℃條件下分別加熱反應4、6、10、15、20、30、60 min。反應結束后，在λex/λem=370 nm/440 nm測定不同反應時間下的熒光值，確定最佳的反應時間。

1.2.3 不同濃度的鎖陽原花青素對甘氨酸/葡萄糖模擬體系中AGEs的抑制作用的影響

實驗參考Zha等[21]方法并略作修改；在葡萄糖/甘氨酸模擬體系中，在溫度為80 ℃條件下，分別加入濃度為0.025、0.05、0.15、0.3、0.5、1.0 mg/mL原花青素各1 mL；溫度為100 ℃條件下，分別加入質量濃度為0.05、0.15、0.3、0.5、1.0 mg/mL原花青素各1 mL；根據1.2.2部分確定的最佳反應時間，反應結束后，在λex/λem=370 nm/440 nm測定其熒光值，對照組和空白組的設置同1.2.2。

1.2.4 金屬離子對鎖陽原花青素抑制葡萄糖/甘氨酸模擬體系AGEs的影響

將Ca2+、Cu2+、Fe2+、Mg2+、Zn2+標準溶液均稀釋為50.0、10.0、1.0、0.1 mg/L四個梯度；配制10.0、1.0、0.1 mg/L的Al3+溶液。在葡萄糖/甘氨酸模擬體系中，取不同種類、不同濃度的金屬離子溶液各0.5 mL，鎖陽原花青素提取液0.5 mL，加入pH為7.4的磷酸鹽緩沖液補足至5 mL。在λex/λem=370 nm/440 nm測定其熒光值，研究不同種類、不同濃度金屬離子對原花青素抑制甘氨酸/葡萄糖模擬體系AGEs的影響。

圖1 不同溫度、不同反應時間下鎖陽中的原花青素對AGEs的抑制效果Fig.1 The inhibition effects of the formation of AGEs at different temperature levels

1.2.5 相對抑制率的計算

依據上述步驟測定不同條件下熒光值，按以下公式計算鎖陽原花青素對葡萄糖/甘氨酸模擬體系AGEs相對抑制率。

F樣品為加入鎖陽原花青素提取液而且加熱的反應液的熒光值；

F對照為不添加原花青素但加熱的模擬體系的熒光值；

F空白為不添加原花青素也不加熱的模擬體系的熒光值。

2 結果與分析

2.1 不同反應時間下鎖陽中的原花青素對葡萄糖/甘氨酸模擬體系AGEs的抑制效果

由圖1A可知，將鎖陽原花青素加入葡萄糖/甘氨酸模擬體系中，在80 ℃下反應不同時間后，原花青素對該體系產生AGEs具有一定的抑制效果；其隨著加熱反應時間的不斷延長，相對抑制率逐漸增加，當加熱反應時間為75 min時，達到最大值(85.73%±1.57%)；且與其它反應時間相比，差異顯著(P<0.05)；當反應時間超過75 min后，抑制率呈現下降趨勢；原因可能是加熱時間過長時，影響原花青素的穩定性，導致其發生降解；

從圖1B可看出，在100 ℃加熱反應條件下，鎖陽原花青素對該體系AGEs抑制作用隨反應時間延長呈現先增加后減小的趨勢；當加熱反應30 min時，相對抑制率達到最大值，為74.01%±1.45%；且差異顯著(P<0.05)；當反應時間大于30 min后，相對抑制率逐漸下降，可能是由于溫度較高，原花青素較長時間加熱促使其熱降解速度加快。

圖2 不同溫度、不同濃度的鎖陽原花青素對AGEs的抑制效果Fig.2 The inhibition effects of the formation of AGEs at different concentrations

2.2 不同濃度鎖陽原花青素對葡萄糖/甘氨酸模擬體系中AGEs的抑制效果

由圖2A可知，在80 ℃的反應條件下，當鎖陽原花青素質量濃度為0.025～0.5mg/mL時，其對模擬體系中產生AGEs的相對抑制率也不斷增加，當其原花青素濃度繼續增加為1.0 mg/mL時，抑制率可達到最大值，且與其它濃度下對AGEs相對抑制差異顯著(P<0.05)；原因可能是在較低濃度原花青素對模擬體系中AGEs的利用效果較好。

在100 ℃的反應條件下，隨著鎖陽原花青素質量濃度逐漸增加，其對體系中AGEs抑制效果呈現先增加后逐漸趨于穩定的趨勢，可能是原花青素對體系中AGEs抑制效果趨于飽和；在高溫環境中，受原花青素穩定性的影響，其結構可能受到破壞，影響其抑制效果。

2.3 金屬離子對鎖陽原花青素抑制AGEs的影響

2.3.1 Al3+對鎖陽原花青素抑制AGEs的影響

表1 不同溫度下Al3+和鎖陽原花青素對AGEs的抑制效果

注：小寫字母不同表示顯著性差異(P<0.05)，以下同。

Note:The different letters on the same list mean significant difference (P<0.05),the same as in the following tables.

從表1 Al3+組可以看出，反應溫度為80 ℃，Al3+的質量濃度為0.1和1.0 mg/L，均可促進甘氨酸/葡萄糖模擬體系AGEs的形成，二者間具有顯著性差異；相反，在100 ℃時條件，不同濃度的Al3+對AGEs的形成均表現一定的抑制作用，均呈現顯著性差異；當Al3+質量濃度為10.0 mg/L時，在不同溫度的反應條件下，均對AGEs形成具有抑制效果。

從Al3++原花青素組可以看出，不同濃度的Al3+在不同溫度的反應條件下都對AGEs的生成具有抑制作用，均呈現顯著性差異。在80 ℃下Al3+的質量濃度為10.0 mg/L時抑制率可達到62.84%±1.95%；在100 ℃時，Al3+不存在時鎖陽原花青素對生成AGEs的抑制率達到最大值(70.87%±3.71%)。結果表明，在不同濃度的Al3+單獨存在時，對葡萄糖/甘氨酸模擬體系中AGEs的生成既有促進也有抑制作用，而在Al3+和鎖陽原花青素共同作用時，在不同濃度，不同反應溫度的條件下，均表現對AGEs的形成起抑制作用。

2.3.2 Cu2+對鎖陽原花青素抑制AGEs的影響

表3 不同溫度下Cu2+和鎖陽原花青素對AGEs的抑制效果

由表2 Cu2+組可知，在80 ℃的條件下Cu2+的質量濃度為0.1和1.0 mg/L時，其對AGEs的生成有促進作用；且0.1 mg/L Cu2+的促進效果較強。在100 ℃時不同濃度的Cu2+對AGEs的生成均有抑制作用，且抑制效果差異顯著(P<0.05)。質量濃度為10.0、50.0 mg/L時，80 ℃和100 ℃條件下對AGEs的生成均表現為抑制作用。在80 ℃時Cu2+可達到的最高抑制率為20.62%±2.59%，在100 ℃時為29.76%±3.46%。

從Cu2++原花青素組可以看出，加入不同濃度的Cu2+，在不同溫度的反應條件下鎖陽原花青素對AGEs的生成均有抑制作用，均呈現顯著性差異。不同濃度的Cu2+存在時，鎖陽原花青素對體系中AGEs的形成的抑制效果均比Cu2+不存在時的抑制效果小，且差異顯著。在80、100 ℃下，Cu2+存在時鎖陽原花青素對體系中形成的AGEs抑制率分別為53.71%±2.84%和70.87%±3.09%；結果表明，在不同濃度的Cu2+單獨存在時，其對體系中AGEs的生成既有促進也有抑制作用，而在Cu2+和鎖陽原花青素共同反應時，在不同濃度，不同溫度的反應條件下，對AGEs的生成均表現為顯著性抑制效果。

2.3.3 Fe2+對鎖陽原花青素抑制AGEs的影響

表3 不同溫度下Fe2+和鎖陽原花青素對AGEs的抑制效果

從表3 Fe2+組可以看出，不同質量濃度下Fe2+在80 ℃和100 ℃時，均對體系中AGEs的生成具有顯著性促進作用。

從Fe2++原花青素組可以看出，在不同溫度的反應條件下，不同濃度的Fe2+存在時，鎖陽原花青素對體系中AGEs的生成具有顯著性抑制作用。在80 ℃反應條件下，Fe2+的質量濃度為50.0 mg/L時，對AGEs生成的最大抑制率為45.59%±2.86%，在100 ℃，Fe2+不存在時，抑制率最大為66.65%±2.86%。結果表明，不同濃度的Fe2+單獨存在時，對AGEs的生成具有促進作用；在不同濃度，不同溫度的反應條件下，Fe2+存在時，鎖陽原花青素對AGEs的生成具有抑制作用。

2.3.4 Mg2+對鎖陽原花青素抑制AGEs的影響

表4 不同溫度下Mg2+和鎖陽原花青素對AGEs的抑制效果

從表8 Mg2+組可以看出，Mg2+濃度為0.1和50 mg/L時，80 ℃和100 ℃對AGEs的生成都有促進作用，100 ℃時質量濃度為50 mg/L的Mg2+促進效果最好；1.0和10 mg/L的Mg2+對AGEs的生成有抑制作用，在100 ℃時1.0 mg/L的Mg2+抑制效果最好，為33.87±3.01%，且差異顯著。

在Mg2++原花青素組可以看出，在80 ℃的反應條件下添加1.0、10.0、50.0 mg/L Mg2+時，鎖陽原花青素對AGEs的抑制作用和無Mg2+時相比，差異顯著；Mg2+不存在與加入0.1和50.0 mg/L的Mg2+存在相比，其對模擬體系利于AGEs的形成，轉變為對AGEs的抑制作用，效果顯著。在80 ℃下50.0 mg/L的 Mg2+的抑制率為31.78±2.41%，在100 ℃時10.0 mg/L Mg2+的抑制率最高達到73.48±3.49%。結果表明，Mg2+存在條件下，其對模擬體系中AGEs的形成，同時兼有促進和抑制兩種作用；然而，原花青素的加入，使其由上述兩種作用轉變為僅有的抑制作用。

2.3.5 Ca2+對鎖陽原花青素抑制AGEs的影響

表5 不同溫度下Ca2+和鎖陽原花青素對AGEs的抑制效果

從表5 Ca2+組可以看出，在80 ℃反應條件下，質量濃度為0.1、1.0和10.0 mg/L Ca2+對模擬體系產生的AGEs具有抑制作用；10.0 mg/L的Ca2的存在時，具有較好的抑制效果；在100 ℃反應條件下，1.0和10.0 mg/L的Ca2+可以抑制體系中AGEs的形成；當50.0 mg/L Ca2+單獨存在時，其對體系中AGEs形成具有促進作用。

從Ca2++原花青素組可知，在Ca2+存在下，鎖陽原花青素對模擬體系中AGEs的抑制效果與無Ca2+存在時均呈現抑制作用；在80 ℃無Ca2+存在時，抑制率達到62.08%±1.71%；100 ℃條件下Ca2+的質量濃度為50.0 mg/L時抑制率達到75.31%±1.77%。結果表明，在Ca2+存在下，其對模擬體系中AGEs的生成表現為促進和抑制兩種作用，當鎖陽原花青素加入后，可消除促進作用，從而表現為抑制作用。

2.3.6 Zn2+對鎖陽原花青素抑制AGEs的影響

表6 不同溫度下Zn2+和鎖陽原花青素對AGEs的抑制效果

從表6 Zn2+組可以看出，在100 ℃反應條件下Zn2+的質量濃度為0.1和50.0 mg/L時，對模擬體系生成的AGEs表現促進作用，且0.1 mg/L的Zn2+的促進效果良好；其他均呈現抑制作用；在80 ℃條件下Zn2+濃度為50.0 mg/L時抑制率為29.87%±1.64%，100 ℃時10.0 mg/L的Zn2+達到41.94±2.57%。

在Zn2++原花青素組中，除100 ℃時0.1 mg/L的Zn2+外，其他不同水平的Zn2+存在時，鎖陽原花青素對生成AGEs的抑制率均低于無Zn2+存在時的抑制率。在80、100 ℃條件下無Zn2+存在時，原花青素對AGEs的抑制率分別為62.41%±1.54%和72.89%±3.24%。結果表明，不同質量濃度的Zn2+對葡萄糖/甘氨酸模擬體系產生的AGEs兼有促進和抑制作用，鎖陽原花青素加入后，消除了原來的促進作用，使其之后全部變為抑制作用。

3 結論

鎖陽原花青素對葡萄糖/甘氨酸模擬體系中AGEs的產生具有一定的抑制效果：在80 ℃時，原花青素對模擬體系中AGEs相對抑制率會隨著反應時間的延長呈現先增加后下降的趨勢，當反應時間為75 min時，達到最大值85.73%±1.57%；在100 ℃條件下，加熱反應時間為30 min時，達到最大值為74.01%±1.45%。

80 ℃反應條件下，隨著鎖陽原花青素質量濃度的增加對AGEs的抑制率也不斷增加，增長趨勢較為緩慢，在鎖陽原花青素的質量濃度1.0 mg/mL時達到最大值；在100 ℃條件下也在1.0 mg/mL時抑制率最大。

在80 ℃或100 ℃時，在體系中加入Al3+、Cu2+、Fe2+、Mg2+、Ca2+和Zn2+，發現金屬離子對AGEs的生成既有促進作用又有抑制作用。在加入1.0 mg/mL的鎖陽原花青素以后，所有的促進作用被逆轉為抑制作用。在加入低濃度金屬離子時，鎖陽原花青素對AGEs的抑制作用與無金屬離子加入時相比稍有所降低，加入高濃度金屬離子時，對鎖陽原花青素抑制AGEs的影響不顯著。