α-半乳糖苷酶及其在飼料中的應(yīng)用

陳國(guó)參， 王佰濤， 徐文濤， 王一雯， 李寒冰， 劉德海

（1.河南省科學(xué)院生物研究所，河南鄭州 450008；2.河南省工業(yè)酶工程技術(shù)研究中心，河南鄭州450008）

α-半乳糖苷酶，又叫蜜二糖酶（α-galactosidase，EC 3.2.1.22），可以催化不同半乳糖苷底物去除 α-1，6-連接的半乳糖殘基（Naumov 等，2004）。大豆和其他豆類作為飼料當(dāng)中豐富的蛋白質(zhì)來源，其中含有高濃度的可溶性低聚糖如棉子糖和水蘇糖等，其在動(dòng)物胃腸道中不能被徹底消化，這些未消化完全的糖進(jìn)入動(dòng)物腸道后會(huì)促進(jìn)有害菌群的增長(zhǎng)，引起脹氣和胃腸道紊亂，嚴(yán)重?fù)p害動(dòng)物的健康，降低動(dòng)物飼料的飼用效率。因此，在動(dòng)物飼料中添加α-半乳糖苷酶制劑可以將這些多余的糖徹底清除，抑制其在腸道中發(fā)酵，減輕動(dòng)物胃腸道脹氣癥狀，避免有害致病菌對(duì)動(dòng)物腸道的損害，提高動(dòng)物的免疫力，增加動(dòng)物腸道對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，提高飼料利用率（Ghazi等，2009）。

1 α-半乳糖苷酶的來源與分類

α-半乳糖苷酶在自然界中廣泛存在，尤其在細(xì)菌、真菌、酵母菌等微生物中分布最廣。α-半乳糖苷酶的細(xì)菌來源有嗜熱芽孢桿菌 （Gote等，2006）、嗜酸乳酸桿菌（Fredslund 等，2011）、發(fā)酵乳桿菌 （Carrerasilva等，2006）、青春雙歧桿菌（Kim 等，1999）、短雙歧桿菌（Xiao 等，2000）等。另外從極端嗜熱菌杜氏桿菌及海洋細(xì)菌假交替單胞菌也分離得到α-半乳糖苷酶 （Gomes等，2000）。據(jù)報(bào)道絲狀放線菌當(dāng)中也含有α-半乳糖苷酶，例如從重紅色鏈絲菌和紅色糖多孢菌中可分離得到α-半乳糖苷酶 （Post等，2005；Elshafei等，2001）。Brouns等（2006）從高酸度陸地火山地區(qū)發(fā)現(xiàn)的超嗜熱古生菌硫磺礦硫化葉菌P2也可分離純化得到α-半乳糖苷酶，這種α-半乳糖苷酶具有極高的熱穩(wěn)定性。此外，在真菌中，米曲霉（Shankar等，2007）、煙曲霉（Gurkok 等，2011）、藤倉(cāng)赤霉（Mulimani等，1995）、簡(jiǎn)青霉（Luonteri等，1998）、嗜熱棉毛菌（Puchart等，2000）及少孢根霉（Han 等，2003）均可作為α-半乳糖苷酶的來源。Wang（2014）等從費(fèi)希新薩托菌中分離得到一種α-半乳糖苷酶，研究結(jié)果表明，其對(duì)豆制品具有高度專一的水解活性。

糖苷水解酶根據(jù)其氨基酸序列相似性，可將其分成135個(gè)家族，即GH-1~GH-135，α-半乳糖苷酶主要?dú)w屬于其中五個(gè)糖苷水解酶 （GH）家族：GH-4、GH-27、GH-36、GH-57 和 GH-97。 其中GH-4家族酶和GH-57家族酶中α-半乳糖苷酶較少，一共只有八種酶具有α-半乳糖苷酶活性，且細(xì)菌來源居多。目前大多數(shù)已知的α-半乳糖苷酶都屬于GH-27家族和GH-36家族。GH-27家族的α-半乳糖苷酶多來自于真核生物，例如：黑曲霉（Vries等，1999）；GH-36 家族酶多來自于原核生物，例如：嗜熱脂肪芽孢桿菌（Fridjonsson等，1999）和嗜熱棲熱菌 （Fridjonsson等，2001）。同一種有機(jī)體中也可以包含GH-27家族和GH-36家族的α-半乳糖苷酶，例如：淺灰白鏈霉菌同時(shí)含有來自GH-27家族和GH-36家族的多種 α-半乳糖苷酶（Gherardini等，1985）。目前報(bào)道的GH-97家族中α-半乳糖苷酶非常少，其中多形擬桿菌來源的α-半乳糖苷酶對(duì)鈣離子具有高度依賴性（Okuyama等，2014）。

2 α-半乳糖苷酶的酶學(xué)特性

2.1 溫度及pH對(duì)酶活性的影響 不同家族的α-半乳糖苷酶其分子量、最適pH及最適溫度等差異較大。大多數(shù)α-半乳糖苷酶的分子量為45~400 ku，以單聚體或多聚體形式存在。大多數(shù)細(xì)菌α-半乳糖苷酶最適pH為6.0~7.5（Gherardini等，1985），真菌和酵母菌α-半乳糖苷酶最適pH為 3.5~5.5（Ulezlo等，1982）。 例如：鏈霉菌屬 sp.S27來源的 α-半乳糖苷酶最適 pH為 7.4（Cao等，2010），費(fèi)希新薩托菌來源的α-半乳糖苷酶最適 pH 為 4.5（Wang等，2014）；疏棉狀嗜熱絲孢菌來源的α-半乳糖苷酶最適pH為4.6~4.8，在pH 4.0~7.0 酶活性穩(wěn)定（Svastits等，2009）；畢赤酵母菌來源的α-半乳糖苷酶最適pH為5.5，在pH 5.5~9.5酶活性穩(wěn)定（Chen等，2015）。由于制糖過程中生產(chǎn)溫度較高，要求一些α-半乳糖苷酶在較高溫度下能夠保持良好的穩(wěn)定性及活性（Gherardini等，1985）。 例如：米赫根毛霉來源的α-半乳糖苷酶最適溫度高達(dá) 55℃（Chen等，2015），疏棉狀嗜熱絲孢菌來源的α-半乳糖苷酶能夠在溫度60~66℃達(dá)到最優(yōu)催化活性，在70℃能保持酶的穩(wěn)定性（Svastits等，2009）。

2.2 金屬離子和糖對(duì)酶活性的影響 眾所周知，許多化學(xué)物質(zhì)都會(huì)對(duì)α-半乳糖苷酶的活性造成影響。 例如：Hg2+、Ag+、Cu2+等陽(yáng)離子對(duì) α-半乳糖苷酶的活性具有顯著的抑制效應(yīng)，主要是因?yàn)槠淇膳c酶活性中心組氨酸上的氨基、羧基、巰基等基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)（Gote等，2006）。一些研究報(bào)道表明，Mn2+、Mg2+、K+等能夠?qū)?α-半乳糖苷酶的活性產(chǎn)生活化效應(yīng)，而大多數(shù)其他金屬陽(yáng)離子對(duì)α-半乳糖苷酶的活性沒有影響或有抑制效應(yīng)（Rezessyszab等，2007）。 Svastits等（2009）研究表明，從嗜熱真菌中提取純化的α-半乳糖苷酶能夠被 Mn2+、Mg2+、K+顯著活化，而 Hg2+、Ag+、Ca2+對(duì)其有顯著的抑制效應(yīng)。此外，α-半乳糖苷酶的活性還會(huì)受到一些糖及糖衍生物的影響，Gote等（2006）研究表明，當(dāng)采用對(duì)硝基苯基-α-D-半乳糖苷作為反應(yīng)底物時(shí)，半乳糖、蜜二糖、棉子糖及水蘇糖都會(huì)對(duì)α-半乳糖苷酶的催化活性產(chǎn)生抑制作用，可能是因?yàn)檫@些化合物的半乳糖殘基和對(duì)硝基苯基-α-D-半乳糖苷的半乳糖殘基結(jié)構(gòu)相似，因此可能會(huì)競(jìng)爭(zhēng)酶的活性位點(diǎn)。Suzuki等（1970）報(bào)道，從葡酒色被孢霉中提取的α-半乳糖苷酶能夠被D-葡萄糖非競(jìng)爭(zhēng)性抑制，而Zapater等（1990）報(bào)道，從無花果曲霉中提取的α-半乳糖苷酶能夠被甘露糖反競(jìng)爭(zhēng)性抑制。

3 α-半乳糖苷酶的結(jié)構(gòu)及催化特點(diǎn)

α-半乳糖苷酶主要由三個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，即N-端結(jié)構(gòu)域、C-端結(jié)構(gòu)域及催化結(jié)構(gòu)域。不同GH家族來源的α-半乳糖苷酶結(jié)構(gòu)有所不同，而α-半乳糖苷酶催化作用與酶的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，不同糖苷酶家族的α-半乳糖苷酶催化特點(diǎn)不同。

GH-4家族酶包括三個(gè)保守殘基，即酪氨酸殘基、半胱氨酸殘基和組氨酸殘基，其在催化反應(yīng)中可以螯合金屬離子，半胱氨酸殘基大多通過去質(zhì)子化活化催化酶。GH-4家族糖苷酶屬于構(gòu)型保持酶，作為GH家族中一種特殊的水解酶，是唯一需要Mn2+等二價(jià)金屬離子及NAD+同時(shí)作為輔助因子來參與催化反應(yīng)的酶。此外，一些GH-4家族糖苷酶還需要還原劑二巰基蘇糖醇及β-巰基乙醇的參與（Suresh 等，2002；Thompson 等，1998）。

GH-27家族酶和GH-36家族酶包含了已知的大多數(shù)α-半乳糖苷酶，且兩個(gè)家族結(jié)構(gòu)相近，二者的催化中心都是（β/α）8桶狀結(jié)構(gòu)，C-端結(jié)構(gòu)域由β折疊股組成。GH-36家族酶與GH-27家族酶擁有相近的催化親核體和質(zhì)子供體，二者α-半乳糖苷酶的氨基酸序列中都存在保守序列 [LIVMFY]-x（2）-[LIVMFY]-x-[LIVM]-D-D-x-[WY]，并且發(fā)現(xiàn)其在GH-36家族的半乳糖苷酶中部附近，而GH-27家族則在氨基端附近（Fridjonsson 等，1999）。 D-D-x-[WY]是半乳糖苷酶的標(biāo)志物，其中D是催化中心部分，起酸堿催化作用。Fujimoto等（2003）報(bào)道，通過多重同晶置換的方法在分辨率1.5 A條件下確定了GH-27家族大米α-半乳糖苷酶晶體結(jié)構(gòu)模型。其主要包括N-端催化結(jié)構(gòu)域及C-端結(jié)構(gòu)域，N-端催化結(jié)構(gòu)域構(gòu)成了一個(gè) （β/α）8桶狀結(jié)構(gòu) （TIM桶狀結(jié)構(gòu)），C-端結(jié)構(gòu)域由含有希臘鑰匙關(guān)鍵基序的八個(gè)β折疊股（β夾層折疊）組成。

GH-57家族酶只包含極少數(shù)α-半乳糖苷酶，與GH-27及GH-36家族酶不同的是其對(duì)蜜二糖和水蘇糖的水解能力較弱 （Lieshout等，2009）。GH-97家族酶包含兩種構(gòu)型的酶，即構(gòu)型翻轉(zhuǎn)酶α-葡萄糖苷酶（BtGH97a）及構(gòu)型保持酶α-半乳糖苷酶（BtGH97b）（Okuyama 等，2009）。對(duì)BtGH97b的晶體結(jié)構(gòu)分析和定點(diǎn)誘變研究結(jié)果表明，其結(jié)構(gòu)包括N-端結(jié)構(gòu)域、C-端結(jié)構(gòu)域及催化中心，其中Asp415作為親核催化劑，催化中心的Ca2+對(duì)于酶的催化作用十分關(guān)鍵 （Okuyama等，2014），其充當(dāng)了路易斯酸的角色。Tracey等（2008）通過與EDTA孵育，發(fā)現(xiàn)孵育之后酶的活性大大降低，驗(yàn)證了GH-97家族α-半乳糖苷酶(BtGH97b)對(duì)于Ca2+的依賴性。

4 α-半乳糖苷酶的作用機(jī)理及應(yīng)用

4.1 α-半乳糖苷的抗?fàn)I養(yǎng)機(jī)理 如表1所示，不同植物種子中都含有不同含量的α-半乳糖苷，其中大豆和棉籽粕當(dāng)中總α-半乳糖苷量最高，含量為5%~9%（Kuo等，1988）。 而這些α-半乳糖苷類進(jìn)入腸道后，經(jīng)過微生物發(fā)酵，轉(zhuǎn)化成揮發(fā)性脂肪酸，能夠產(chǎn)生二氧化碳和甲烷等氣體，引起動(dòng)物胃腸道脹氣，使得動(dòng)物進(jìn)食減少，降低動(dòng)物的生長(zhǎng)速度。并且這些未消化的食物還會(huì)增加腸道食糜的滲透壓，加快腸道對(duì)食糜的排空速度，從而降低動(dòng)物對(duì)能量和蛋白質(zhì)的攝取效率，對(duì)動(dòng)物的生長(zhǎng)產(chǎn)生負(fù)面影響。

4.2 α-半乳糖苷酶的作用機(jī)理 添加α-半乳糖苷酶后，可以加速降解α-半乳糖苷等抗?fàn)I養(yǎng)因子，防止腸道微生物過度發(fā)酵，產(chǎn)生有害氣體。同時(shí)α-半乳糖苷酶對(duì)糖苷的降解也能夠防止致病菌在動(dòng)物腸道上聚集，抑制有害致病菌對(duì)動(dòng)物腸道的損害，提高動(dòng)物的免疫力，避免在飼料當(dāng)中使用抗生素。馬慧慧等（2013）研究報(bào)道，在肉雞飼料中添加α-半乳糖苷酶后，檢測(cè)其血液生化指標(biāo)及微生物菌群數(shù)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肉雞白蛋白含量顯著升高，腸道有害菌群數(shù)量下降，有益菌群數(shù)量上升；此外，α-半乳糖苷酶可以破壞植物細(xì)胞細(xì)胞壁的完整性，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、淀粉等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的釋放，增加動(dòng)物腸道對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，提高飼料的利用效率。細(xì)胞壁作為植物細(xì)胞的重要組成部分，能夠保持細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓，而α-半乳糖苷酶可以破壞細(xì)胞壁降低動(dòng)物腸道滲透壓，避免水分在腸道滯留時(shí)間過長(zhǎng)，減弱腸道內(nèi)食糜的蠕動(dòng)，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收。因此，通過在動(dòng)物飼料中添加α-半乳糖苷酶能夠促進(jìn)動(dòng)物對(duì)飼料更好的吸收利用。

表1 不同植物干種子中α-半乳糖苷的含量%

4.3 α-半乳糖苷酶在飼料中的應(yīng)用 大豆在豆類當(dāng)中營(yíng)養(yǎng)價(jià)值最高，粗蛋白質(zhì)含量高達(dá)30%~50%，大豆當(dāng)中所含營(yíng)養(yǎng)成分能夠滿足家禽和家畜對(duì)營(yíng)養(yǎng)的需求。但是因大豆當(dāng)中含有抗?fàn)I養(yǎng)因子即糖苷類物質(zhì)，造成大豆的利用率較低。研究表明，可以通過熱乙醇提取法將這些糖苷類化合物從大豆當(dāng)中提取出來，但是在提取過程中會(huì)破壞其中的氨基酸和免疫原性蛋白 （Coon等，1990），從而降低家禽和家畜的免疫力。因此在飼料中添加α-半乳糖苷酶制劑，糖苷類物質(zhì)可以被內(nèi)源性消化酶所降解，避免動(dòng)物胃腸道不良反應(yīng)，提升大豆的蛋白質(zhì)生物利用度。

Baucells等（2016）在生長(zhǎng)豬和肥育豬的飼料中添加α-半乳糖苷酶制劑，研究結(jié)果表明，與對(duì)照組相比試驗(yàn)組生長(zhǎng)豬和肥育豬的體重明顯增加，各項(xiàng)指標(biāo)明顯提升。Ghazi等（2003）在肉雞大豆飼料中添加α-半乳糖苷酶制劑，結(jié)果表明，肉雞對(duì)大豆飼料的消化效率提高，增加了大豆飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。蔣小豐等（2009）通過向約克純種斷奶仔豬的玉米大豆飼料中添加不同劑量的α-半乳糖苷酶制劑，分析其對(duì)斷奶仔豬生產(chǎn)性能的影響，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，加酶組仔豬生產(chǎn)性能和生化指標(biāo)均有明顯改善，對(duì)蛋白質(zhì)利用率顯著提高，同時(shí)增加了對(duì)粗纖維、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪的表觀消化率。戴求仲等（2010）在飼料中添加α-半乳糖苷酶制劑研究其對(duì)黃羽肉雞生產(chǎn)性能的影響，結(jié)果表明，添加酶制劑后可以降解飼料中的α-半乳糖苷，改變腸道底物組成，促進(jìn)有益菌的生長(zhǎng)，抑制有害菌的生長(zhǎng)，改善肉雞生長(zhǎng)狀況，能夠明顯降低肉雞后期和全期料重比，改善試驗(yàn)雞生產(chǎn)性能。繆志軍等（2010）在飼料中添加α-半乳糖苷酶制劑研究其對(duì)番鴨增重和生產(chǎn)性能的影響，結(jié)果表明，其能夠提高番鴨增重，改善生產(chǎn)性能。

5 結(jié)語(yǔ)與展望

α-半乳糖苷酶作為一種糖苷水解酶，在生產(chǎn)生活中應(yīng)用廣泛，尤其是在飼料領(lǐng)域應(yīng)用前景較好，通過在動(dòng)物飼料中添加α-半乳糖苷酶制劑，對(duì)動(dòng)物飼料中存在的半乳糖苷等抗?fàn)I養(yǎng)因子進(jìn)行降解，可以改善動(dòng)物胃腸道不良反應(yīng)，促進(jìn)動(dòng)物對(duì)飼料中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用效率，提高飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。但是α-半乳糖苷酶提取純化工藝較復(fù)雜，熱穩(wěn)定性和酶活性不高，限制了其在生產(chǎn)中的應(yīng)用，目前通過基因工程技術(shù)可以構(gòu)建新型產(chǎn)α-半乳糖苷酶的工程菌，能夠完成高效高活性生產(chǎn)α-半乳糖苷酶的任務(wù)，為該酶的開發(fā)利用打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，因此，α-半乳糖苷酶的開發(fā)潛力不容忽視。