納米蒙脫石對(duì)奶牛日糧中黃曲霉毒素B1的吸附效果研究

尚佳琪，周東年，王雅晶，劉 瀟，李勝利，盧 娜

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，北京市生鮮乳質(zhì)量安全工程技術(shù)研究中心，北京海淀100193）

黃曲霉毒素（AFs），主要是由曲霉屬中的黃曲霉（Aspergillus flavus）和寄生曲霉（A.parasiticus）代謝產(chǎn)生的一類化學(xué)結(jié)構(gòu)、致毒基團(tuán)和理化性質(zhì)相似的毒性極強(qiáng)的次生代謝產(chǎn)物。目前已分離鑒定出的黃曲霉毒素有20余種，主要是黃曲霉毒素 B1、B2、G1、G2以及由 B1和 B2經(jīng)過羥化作用而衍生成的代謝產(chǎn)物黃曲霉毒素M1和M2，且M1和M2主要存在于牛奶中 。這些常見的AFs中，毒性及致癌性最強(qiáng)的是AFB1，然后依次是AFM1、AFG1、AFB2和 AFG2。 其中，AFB1和 AFM1在1993年和2002年分別被世界衛(wèi)生組織癌癥研究機(jī)構(gòu)劃分為I類致癌物（齊琪，2012；Bickers等，1994）。

霉菌毒素的污染問題日趨嚴(yán)重，若檢查處理措施不當(dāng)，會(huì)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失以及食品安全等問題。當(dāng)奶牛食入污染AFB1的飼料時(shí)，會(huì)引起免疫系統(tǒng)失調(diào)紊亂，導(dǎo)致肝臟和腎臟的脂肪酸沉積，引發(fā)腦病和水腫病，以及真胃變位、子宮炎、乳房炎等疾病的發(fā)生。此外，AFB1會(huì)抑制蛋白質(zhì)的合成，使血清蛋白濃度發(fā)生變化，嚴(yán)重影響奶牛的體況和生產(chǎn)性能（黃祿華等，2013；陳波，2013；程廣龍等，2012；張治淮等，2012）。在霉菌毒素的防治上，預(yù)防是最簡(jiǎn)單廉價(jià)的措施，需嚴(yán)格把握飼料原料的儲(chǔ)存和運(yùn)輸過程中的環(huán)境條件以及對(duì)水分的控制。除預(yù)防之外，霉菌毒素吸附劑的使用也很有必要。霉菌吸附劑具有體外吸附和體內(nèi)抑制霉菌毒素的能力，是目前最常用的脫毒法。本試驗(yàn)選取一種納米蒙脫石吸附劑，通過與黃曲霉毒素B1同時(shí)添加在奶牛日糧中，旨在研究納米蒙脫石吸附劑的吸附效果，降低毒素在牛奶中的殘留。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 試驗(yàn)所用納米蒙脫石吸附劑購(gòu)自浙江某公司，產(chǎn)品為灰白色粉末。納米蒙脫石具有特殊的晶層結(jié)構(gòu)，由于各晶層間的靜電不平衡使得層面具有電負(fù)性，對(duì)體積較小的黃曲霉毒素具有很大吸附力。

試驗(yàn)所用黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自廣州寶柏貿(mào)易有限公司，品牌為Enzo Life Sciences，產(chǎn)品純度高達(dá)98%以上。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理 選取產(chǎn)奶量 [（36.2±3.5）kg]、胎次[（1.8±0.5）胎]和泌乳天數(shù)[（140±15）d]相近的健康荷斯坦泌乳牛45頭，按每組15個(gè)重復(fù)隨機(jī)分為3組，每個(gè)重復(fù)1頭牛。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗(yàn)Ⅰ組在基礎(chǔ)日糧中添加0.1 mg/kg的黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品，試驗(yàn)Ⅱ組在基礎(chǔ)日糧中添加0.1 mg/kg的黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品+3 g/kg的納米蒙脫石吸附劑 （于每日晨飼時(shí)在基礎(chǔ)日糧中添加樣品，攪拌均勻）。試驗(yàn)在中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)順義基地進(jìn)行，試驗(yàn)牛在同一牛舍散欄飼養(yǎng)，每日分3次飼喂全混合日糧（TMR）（8：00、14：00、20：00），并保證5%的剩料量，自由飲水，每日于擠奶廳擠奶3次（7：00、13：00、19：00）。 試驗(yàn)期間使用動(dòng)物采食監(jiān)控系統(tǒng)（AIMS）監(jiān)控奶牛采食量。預(yù)試期7 d，正試期 14 d，共 21 d。

1.3 試驗(yàn)日糧 試驗(yàn)期間以牧場(chǎng)TMR為基礎(chǔ)日糧，日糧參照NRC（2001）配制。三組日糧除樣品添加不同，其他原料組成完全相同。基礎(chǔ)日糧組成和營(yíng)養(yǎng)水平見表1。

1.4 指標(biāo)測(cè)定及方法

1.4.1 飼料樣品的采集與營(yíng)養(yǎng)成分的測(cè)定 試驗(yàn)期間每7 d采集一次基礎(chǔ)日糧和剩料，采集樣品用四分法進(jìn)行收集，將所收集樣品置于65℃烘箱烘干48 h，回潮48 h后制成風(fēng)干樣，粉碎后保存待測(cè)。根據(jù)張麗英（2016）所述方法對(duì)常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行分析。

表1 試驗(yàn)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）

1.4.2 干物質(zhì)采食量的測(cè)定 試驗(yàn)期間利用AIMS系統(tǒng)記錄每日采食量與剩料量，計(jì)算干物質(zhì)采食量（DMI）。

1.4.3 產(chǎn)奶量、乳成分及牛奶中黃曲霉毒素M1的測(cè)定 試驗(yàn)期間每天記錄每頭奶牛的產(chǎn)奶量。于正試期第0天、第7天、第14天按早中晚4∶3∶3混合均勻共100 mL采集奶樣，所得奶樣其中50 mL加入重鉻酸鉀防腐劑及時(shí)送至北京奶牛中心做乳成分測(cè)定，測(cè)定指標(biāo)包括：乳蛋白率、乳脂率、乳糖率、體細(xì)胞數(shù)和乳固形物的含量。其余50 mL送至北京萊博泰瑞科技發(fā)展公司測(cè)定牛奶中黃曲霉毒素M1的含量。

1.4.4 血液指標(biāo)的測(cè)定 于正試期第0天、第7天、第14天每組隨機(jī)挑選5頭牛，于晨飼前用真空采血管進(jìn)行尾根采血10 mL。所采集血液置于4000 r/min離心機(jī)，10 min后，將所得血清分裝在1.5 mL離心管中-20℃保存待測(cè)。血樣送至北京萊博泰瑞科技發(fā)展公司測(cè)定，測(cè)定指標(biāo)包括：谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOP）、堿性磷酸酶（ALP）和黃曲霉毒素B1的含量。

1.4.5 黃曲霉毒素轉(zhuǎn)化率

轉(zhuǎn)化率/%=牛奶中黃曲霉毒素M1檢出量/日糧中黃曲霉毒素B1添加量×100。

1.5 數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)先使用Excel 2007進(jìn)行初步整理，之后采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，Duncan氏多重比較法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，顯著水平定為P＜0.05，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

表2 添加AFB1和吸附劑對(duì)奶牛生產(chǎn)性能和牛奶中AFM1含量的影響

2 結(jié)果與分析

2.1 DMI、產(chǎn)奶量、乳成分和牛奶中黃曲霉毒素M1含量 如表2所示，試驗(yàn)Ⅰ組的產(chǎn)奶量分別較對(duì)照組和試驗(yàn)Ⅱ組降低0.64 kg/d和0.50 kg/d（P＜0.05）；試驗(yàn)Ⅰ組的4%校正乳分別較對(duì)照組和試驗(yàn)Ⅱ組降低1.01 kg/d和0.65 kg/d （P＜0.05）；試驗(yàn)Ⅰ組牛奶中黃曲霉毒素M1分別較對(duì)照組和試驗(yàn)Ⅱ組提高 1.57 μg/L 和 1.44 μg/L（P ＜ 0.05），試驗(yàn)Ⅱ組稍高于對(duì)照組，但無顯著差異（P＞0.05）；三組之間DMI和各項(xiàng)乳成分均無顯著差異。

2.2 血清中酶活性和黃曲霉毒素B1含量 如表3所示，霉菌毒素的添加會(huì)很明顯的影響血清中相關(guān)酶的活性和AFB1的含量。除GPT活性在三組間無顯著差異外（P＞0.05），試驗(yàn)Ⅰ組的GOT和ALP活性以及AFB1的含量分別較對(duì)照組和試驗(yàn)Ⅱ組顯著提高了 8.86、5.31、1.23 U/L （P ＜0.05），8.64、4.25、1.20 U/L（P ＜ 0.05），其中，對(duì)照組和試驗(yàn)Ⅱ組的各項(xiàng)指標(biāo)均未產(chǎn)生顯著性差異（P ＞ 0.05）。

表3 添加AFB1和吸附劑對(duì)奶牛血清酶活性和AFB1含量的影響U/L

3 討論

3.1 DMI、產(chǎn)奶量、乳成分和牛奶中黃曲霉毒素M1含量 大量研究表明，奶牛日糧在被黃曲霉毒素污染時(shí)，會(huì)直接影響奶牛的生產(chǎn)性能。國(guó)內(nèi)外對(duì)于黃曲霉毒素和吸附劑應(yīng)用的研究較多。Kutz等（2009）在泌乳中期奶牛日糧中添加黃曲霉毒素B1和吸附劑后發(fā)現(xiàn)，奶牛的產(chǎn)奶量、干物質(zhì)采食量以及乳成分都沒有發(fā)生顯著性的變化。Queiroz等（2012）在受到黃曲霉毒素污染的日糧中添加了不同劑量的吸附劑后得出結(jié)論，吸附劑的使用并沒有改變奶牛干物質(zhì)采食量和產(chǎn)奶量。熊江林（2014）發(fā)現(xiàn)，不同添加水平的吸附劑并沒有顯著改善采食被污染日糧的奶牛生產(chǎn)性能。齊琪（2012）在研究中發(fā)現(xiàn)，黃曲霉毒素B1對(duì)奶牛日糧的污染并沒有影響到奶牛的產(chǎn)奶量和乳脂、乳蛋白，但乳糖含量卻顯著上升。本研究中，吸附劑的使用對(duì)奶牛的干物質(zhì)采食量和乳成分沒有產(chǎn)生影響，但是顯著提高了奶牛的產(chǎn)奶量和4%校正乳產(chǎn)量。各研究得出結(jié)論不同的原因可能與黃曲霉毒素B1和吸附劑的添加量水平不同、吸附劑種類不同以及日糧組成差異等有關(guān)。

黃曲霉毒素在奶牛機(jī)體中代謝迅速，奶牛在采食被黃曲霉毒素B1污染的日糧后，黃曲霉毒素M115 min后就會(huì)出現(xiàn)在血液中，12 h后就會(huì)出現(xiàn)在牛奶中，24 h后可達(dá)到最大濃度 （Moschini等，2010）。當(dāng)停止采食被污染日糧72 h后，牛奶中不再會(huì)檢測(cè)出黃曲霉毒素 M1（Masoero等，2007）。經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，日糧中的黃曲霉毒素B1轉(zhuǎn)化為牛奶中的黃曲霉毒素M1存在線性規(guī)律，其轉(zhuǎn)化率為0.1%~6%（Coffey 等，2009），馬美蓉等（2014）表明，轉(zhuǎn)化率的平均理論值為1.7%。Kutz等（2009）在研究中得出，轉(zhuǎn)化率為1.42%~2.65%。本試驗(yàn)中，黃曲霉毒素B1添加水平為100 μg/kg，牛奶中黃曲霉素M1檢出量為1.62 μg/L，轉(zhuǎn)化率為1.62%，與前人研究結(jié)果相似。在我國(guó)乳及乳制品黃曲霉毒素M1限量標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定，鮮奶中黃曲霉毒素M1的限量標(biāo)準(zhǔn)為 0.5 μg/kg（梁江等，2013），本試驗(yàn)通過吸附劑的使用，使牛奶中的黃曲霉毒素M1從1.62 μg/L下降至 0.18 μg/L，低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)限制（0.5 μg/L），說明此吸附劑對(duì)毒素吸附效果良好。

3.2 血清中酶活性和黃曲霉毒素B1含量 黃曲霉毒素B1對(duì)動(dòng)物體肝臟危害最大，毒素在肝臟蓄積后容易引起肝癌。ALP、GOP和GPT三種酶是評(píng)估肝臟功能是否正常的重要指標(biāo)，這三種酶的活性會(huì)由肝細(xì)胞的破損而增加。齊琪（2012）表明，日糧中添加20 μg/kg和40 μg/kg的黃曲霉毒素B1對(duì)反映肝臟功能的酶活性無顯著影響。熊江林（2014）在奶牛日糧中添加20 μg/kg黃曲霉毒素B1后得出相似結(jié)論。Helferich等（1986）在肉牛的日糧中添加600 μg/kg的黃曲霉毒素B1，結(jié)果顯示，無論是在飼喂毒素期間還是觀察期間，均觀察到肝臟的病變現(xiàn)象。在本試驗(yàn)中，黃曲霉毒素B1的添加量為100 μg/kg，試驗(yàn)結(jié)果顯示，GOT和ALP酶活性顯著上升，說明黃曲霉毒素B1會(huì)影響奶牛的肝臟功能。但是與前人研究結(jié)果相比，對(duì)反映肝臟功能的酶活性的影響卻不同。推測(cè)導(dǎo)致結(jié)果不同的原因可能是黃曲霉毒素B1的添加量不同，但是具體能影響到酶活性的添加量水平需要進(jìn)一步考證。

黃曲霉毒素B1不僅會(huì)影響到動(dòng)物的生產(chǎn)性能，毒素還會(huì)沉積在動(dòng)物的肝臟、腎臟、血液以及肌肉中，影響機(jī)體健康。本試驗(yàn)中，隨著黃曲霉毒素B1的添加，血清中黃曲霉毒素B1含量顯著上升，但是通過添加吸附劑后，毒素水平可降低至正常水平，進(jìn)一步肯定了吸附劑對(duì)毒素的吸附作用。

4 結(jié)論

4.1 日糧中添加0.1 mg/kg黃曲霉毒素B1，奶牛的產(chǎn)奶量和4%校正乳顯著下降，牛奶中黃曲霉毒素M1含量顯著上升，血清中GOP和ALP活性顯著增強(qiáng)以及血清中黃曲霉毒素B1含量顯著上升。

4.2 在黃曲霉毒素B1污染的日糧中添加3 g/kg的納米蒙脫石吸附劑可有效緩解奶牛產(chǎn)奶量下降、有效吸附黃曲霉毒素B1，牛奶中黃曲霉毒素M1的含量符合國(guó)家最高限量標(biāo)準(zhǔn)。