呼吸道病原體核酸恒溫擴增芯片十三聯(lián)檢在下呼吸道感染診斷中的價值

李艷燕 高美麗 賽亞飛 傅恩清

下呼吸道感染是指聲門以下的氣道感染，根據(jù)世界衛(wèi)生組織2013年發(fā)布最新的統(tǒng)計結(jié)果,下呼吸道感染位列世界十大死因中的第三位(5.9%)，其導(dǎo)致的嚴重疾病已經(jīng)成為全球關(guān)注的公共衛(wèi)生問題[1]。引起下呼吸道感染的病原體主要有細菌、病毒、支原體、衣原體等[2-3]。目前臨床病原菌檢測主要依靠傳統(tǒng)細菌培養(yǎng)和血清學檢測相關(guān)抗體的方法，但由于操作方法繁瑣，獲得結(jié)果周期較長，每次只能鑒定一種病原體，且陽性檢出率低，僅有30%～40%[4]，因此建立一種高效、敏感、快速、準確的病原學檢測方法，對臨床早期診斷和精準治療有著至關(guān)重要的作用。本研究應(yīng)用恒溫擴增和微流控碟式芯片相結(jié)合的技術(shù)，對13種常見下呼吸道病原體靶基因進行擴增和檢測，并與呼吸道常見病原體分離與培養(yǎng)檢出情況進行比較，評價LAMP十三聯(lián)檢在下呼吸道感染中的價值，旨在為臨床提供更為快速可靠的實驗室診斷依據(jù)。

資料和方法

一、一般資料

收集唐都醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科2018年1月至2018年7月可疑下呼吸道感染患者266例，其中男194例，女72例，年齡15～92歲，平均年齡(61.22±14.66)歲。臨床癥狀主要為發(fā)熱、咳嗽咳痰，伴或不伴胸痛及呼吸困難，查體呼吸音粗糙伴或不伴干/濕性啰音，胸部X線片或胸部CT掃描等影像學提示下呼吸道感染。

二、檢測方法

1. 標本采集： 通過支氣管鏡檢查收集266例下呼吸道痰液，每例樣本量不少于0.6 ml，置于相應(yīng)的無菌樣本收集管內(nèi)立即送檢。

2. 儀器和試劑： LAMP十三聯(lián)檢試劑盒及 RTisochipTM恒溫擴增微流控芯片核酸分析儀購自博奧生物集團有限公司。呼吸道病原體分離與培養(yǎng)的試劑與材料及全自動微生物鑒定儀(VITEK2-Compact)均購自梅里埃生物公司(法國)。

3. LAMP十三聯(lián)檢： 按試劑盒要求收集、轉(zhuǎn)運、處理及提取基因組DNA核酸，采用恒溫擴增、微流控碟式芯片相結(jié)合的技術(shù)，利用具有鏈置換功能聚合酶在恒溫(65 ℃)條件下進行靶核酸擴增，熒光染料摻入法進行實時熒光檢測，應(yīng)用RTisochip TM恒溫擴增微流控芯片核酸分析儀和相應(yīng)軟件進行結(jié)果分析，一步完成對13種常見下呼吸道病原菌的檢測，包括肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌、流感嗜血桿菌、嗜肺軍團菌、結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群、肺炎支原體、肺炎衣原體[5]。

4. 病原體的分離與培養(yǎng): 將合格的痰標本接種于血平板、加萬古霉素巧克力平板、麥康凱瓊脂平板，置于35 ℃的5%二氧化碳環(huán)境培養(yǎng)24 h或48 h觀察培養(yǎng)基，篩選可能致病菌應(yīng)用法國梅里埃VITEK2-Compact全自動微生物鑒定儀進行鑒定。

三、統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS 22.0軟件進行處理，計數(shù)資料以百分比(%)表示，檢出率比較采用相關(guān)樣本的配對χ2檢驗，P<0.05為差別有統(tǒng)計學意義，檢驗結(jié)果的一致性分析采用Kappa分析，Kappa>0.4具有一致性。

結(jié) 果

一、LAMP十三聯(lián)檢對下呼吸道感染常見病原體基因的檢出情況

266例痰標本中，共檢測出呼吸道病原體陽性標本為155例，總陽性率為58.27%。單種病原體感染90例(33.83%)，混合感染66例(24.81%)，2種混合感染47例(71.21%)，3種及以上混合感染19例(28.79%)，其中以鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌、嗜麥芽窄食單胞菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的混合感染為主，大腸埃希菌多為混合感染。155例陽性標本中包含11種呼吸道病原體，其中陽性率鮑曼不動桿菌占21.05%(56/266)、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌20.30%(54/266)、銅綠假單胞菌12.03%(32/266)，居于前三位。未檢出肺炎衣原體及嗜肺軍團菌，見表1。

表1 LAMP十三聯(lián)檢下呼吸道感染患者病原體分布情況[n(%)]

二、痰培養(yǎng)結(jié)果

微生物病原體分離培養(yǎng)的257例標本(排除結(jié)核感染和肺炎支原體感染)，共92例標本培養(yǎng)陽性，陽性率35.80%。其中鮑曼不動桿菌44株(47.83%)，銅綠假單胞菌23株(25.00%)，肺炎克雷伯菌8株(8.70%)，嗜麥芽窄食單胞菌6株(6.52%)，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌6株(6.52%)，大腸埃希菌4株(4.35%)，流感嗜血桿菌1株(1.09%)，肺炎鏈球菌及金黃色葡萄球菌未培養(yǎng)出。

三、LAMP 十三聯(lián)檢與培養(yǎng)對下呼吸道常見病原體檢出情況比較

同時進行LAMP十三聯(lián)檢與微生物病原體分離培養(yǎng)的257例樣本(排除結(jié)核感染和肺炎支原體感染樣本)，LAMP檢出病原體陽性標本147例，其總陽性率為57.20%(147/257)；病原體分離培養(yǎng)檢出陽性標本共92例，其總陽性率為35.80%(92/257)。兩種檢測結(jié)果的一致性為69.26%(178/257)，陽性符合率為32.08%(68/212)，陰性符合率為82.09%(110/134)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=23.657，P=0.000)。對于鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌，兩種方法的檢出率相一致，肺炎克雷伯、嗜麥芽窄食單胞菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，兩種方法的檢出率差異有統(tǒng)計學意義，LAMP十三聯(lián)檢顯著高于傳統(tǒng)培養(yǎng)法。檢出一致性較高的分別為大腸埃希菌(Kappa值0.536)、鮑曼不動桿菌(Kappa值0.637)、銅綠假單胞菌(Kappa值0.717)，見表2。

討 論

LAMP十三聯(lián)檢技術(shù)最先是在2000年由 Notomi 等[6]新開發(fā)的一種自動循環(huán)的鏈置換核酸恒溫擴增技術(shù)。其主要針對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計4種特異引物，通過鏈置換DNA聚合酶在65 ℃的恒溫條件下完成一系列核酸擴增反應(yīng)。由于該技術(shù)不需要經(jīng)過模板的熱變性、高溫變性和低溫退火過程，不存在溫度變化引起的時間損耗、電泳、紫外觀察等過程，整個過程在1 h內(nèi)即可完成[7-9]，大大縮短了檢驗周期。本研究采用的呼吸道病原菌核酸檢測試劑盒利用恒溫擴增芯片技術(shù)及高速數(shù)字信號處理技術(shù)相結(jié)合，使檢測方法簡單快速、試劑耗量低、自動化程度高，提高了檢測敏感性，具備了對呼吸道感染性疾病的快速診斷能力[10-13]。國內(nèi)已有使用該方法檢測病原體的相關(guān)報道[14-16]，但未見國外的相關(guān)報道。

本研究對266例疑似下呼吸道感染患者的痰液樣本進行檢測，結(jié)果表明呼吸道病原體陽性標本155例，總陽性率為58.27%，單種病原體感染90例，混合感染66例，2種混合感染47例，3種及以上混合感染19例，并以銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌混合感染為主。共檢出呼吸道病原體11種，其中鮑曼不動桿菌(21.05%)、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(20.30%)、銅綠假單胞菌(12.03%)檢出率較高，而肺炎克雷伯菌、流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、大腸埃希菌的檢出率均低于10%，且大腸埃希菌不單獨存在，多于其他病原體共同存在。本研究中肺炎衣原體、嗜肺軍團菌未檢出。陳愉生等[17]的研究報道，下呼吸道感染的病原菌主要是銅綠假單胞菌、流感嗜血桿菌、肺炎克雷伯菌和肺炎鏈球菌。這與本研究結(jié)果不同，這可能與我院是省級三甲醫(yī)院，患者來院就診之前已經(jīng)應(yīng)用抗生素治療，病原菌已經(jīng)耐藥，因而檢出的病原菌大多數(shù)是多耐藥或泛耐藥致病菌有關(guān)。

表2 LAMP 十三聯(lián)檢與培養(yǎng)法對各病原體檢測的符合率比較

注：“-”肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌培養(yǎng)為陰性，未做統(tǒng)計學分析

LAMP十三聯(lián)檢與培養(yǎng)的257例樣本(排除結(jié)核感染和肺炎支原體感染樣本)病原菌檢出情況相比較，病原體分離培養(yǎng)的陽性標本為92例，陽性率為35.80%，LAMP檢出病原體陽性標本147例，陽性率為57.20%；LAMP的陽性率顯著高于培養(yǎng)的陽性率，差異具有統(tǒng)計學意義。本研究與唐睿珠等[18]研究結(jié)果相一致。LAMP十三聯(lián)檢較傳統(tǒng)培養(yǎng)法病原體檢出率高的原因可能是：①LAMP十三聯(lián)檢是從微量拷貝中獲得目的基因，敏感性較高；②傳統(tǒng)培養(yǎng)對培養(yǎng)的條件要求高，培養(yǎng)周期較長；③傳統(tǒng)培養(yǎng)對培養(yǎng)的技術(shù)要求也較高，要求專門的培養(yǎng)基以及專業(yè)的技術(shù)人員；④部分病原體如流感嗜血桿菌，由于易受用藥的影響，使培養(yǎng)陽性率降低。本研究中兩種檢測方法的結(jié)果一致性為69.26%，陽性符合率為32.08%，陰性符合率為82.09%。兩種方法的陽性符合率較低，而陰性符合率較高，可能與傳統(tǒng)痰液培養(yǎng)法病原體檢出率較低有關(guān)。

本研究的缺陷是未對LAMP十三聯(lián)檢檢出的8例結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群進一步分離與培養(yǎng)統(tǒng)計，無法進一步評價LAMP十三聯(lián)檢在肺結(jié)核中的價值。由于本研究檢出1例肺炎支原體，未檢出嗜肺軍團菌、肺炎衣原體，無法進行血清抗體檢測，所以無法評價LAMP十三聯(lián)檢在非典型病原體感染中的價值。

綜上所述，呼吸道病原體核酸恒溫擴增芯片十三聯(lián)檢較傳統(tǒng)細菌培養(yǎng)檢測更具有高效、快速、敏感、簡單及覆蓋面廣的優(yōu)點，可為臨床診治提供快捷可靠的實驗室依據(jù)，對臨床早期診斷和精準治療有著至關(guān)重要的作用。