芍藥苷對慢性阻塞性肺疾病的療效分析

譚 丹 曾小琴 徐 偉 周人杰

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)，是一種以氣流持續(xù)受限、進(jìn)行性肺功能下降為主要特征的常見慢性呼吸系統(tǒng)疾病，其主要的臨床表現(xiàn)有咳嗽、咯痰、胸悶、氣喘，甚至呼吸困難等[1-2]。嚴(yán)重影響患者正常的工作、生活以及社交活動，甚至導(dǎo)致患者勞動力的喪失，使患者的生存質(zhì)量直線下降，危害人類的身心健康，給家庭和社會都造成了沉重的負(fù)擔(dān)。近年來，隨著全球人口老齡化的加劇，COPD的發(fā)病率及病死率呈逐年上升趨勢，其引發(fā)的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)也隨之持續(xù)上升，預(yù)計到2020年，COPD將會占到世界排名前3位的死亡原因之一[3-5]。COPD的病理基礎(chǔ)為炎癥反復(fù)作用下，引起氣道重塑的不可逆性[6]。目前認(rèn)為，引起COPD發(fā)病最主要的危險因素是吸煙，因?yàn)橄銦熤械挠泻Τ煞忠约把踝杂苫蓳p傷氣管的上皮細(xì)胞、誘發(fā)肺內(nèi)發(fā)生炎性反應(yīng)等，從而進(jìn)一步導(dǎo)致COPD的發(fā)生[7]。

Toll樣受體(toll-like receptor, TLR)，作為介導(dǎo)天然免疫的一類重要模式識別性受體，其介導(dǎo)的相關(guān)信號通路在炎癥發(fā)生、發(fā)展以及變化中均起著重要的作用[8-9]。不同的TLRs對應(yīng)識別與其相關(guān)的病原分子模式(pathogen-associated molecular pattern, PAMP)，其中，TLR2主要為革蘭陽性菌受體，識別對應(yīng)配體，可進(jìn)行信號傳導(dǎo)并使核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor-κB, NF-κB)活化，NF-κB活化后可啟動白細(xì)胞介素-1(interleukin-1, IL-1)、白細(xì)胞介素-8(interleukin-8, IL-8)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)等一系列的前炎性反應(yīng)細(xì)胞因子發(fā)生轉(zhuǎn)錄表達(dá)[10]。目前，在西醫(yī)西藥中，尚缺乏能夠有效阻止該病病情發(fā)展的理想藥物和治療方案。研究表明芍藥苷(paeoniflorin, PF)具有抗炎、抗氧化等藥理作用，但芍藥苷在COPD領(lǐng)域中的研究卻尚未見文獻(xiàn)報道[11]。本文通過脂多糖聯(lián)合煙熏的方式建立COPD大鼠模型，觀察芍藥苷對COPD大鼠的作用，并探討其可能機(jī)制。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

72只SD雄性大鼠，體質(zhì)量180～220 g范圍內(nèi)，均來自重慶醫(yī)科大學(xué)的SFP級實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證編號為：SCXK(渝)2012-0001。芍藥苷：純度≥98%，批號20161203，成都曼思特生物科技股份有限公司；孟魯司特鈉：批號20160804，四川大冢制藥股份有限公司。脂多糖：批號092M3，美國Sigma 公司；五牛牌香煙：煙氣中一氧化碳(CO)含量為12 mg，焦油含量為11 mg，煙氣煙堿含量為0.8 mg川渝中煙工業(yè)有限公司。ELISA試劑盒：R&D公司(美國)；成像系統(tǒng)：HITMAS-30(日本)。

二、研究方法

將72只大鼠采用“隨機(jī)數(shù)字表法”隨機(jī)分為6組：正常對照組(A組)，COPD模型組(B組)，芍藥苷低、中、高劑量組(分別為C組、D組、E組)，西藥組(F組)。其中，芍藥苷低、中、高組劑量分別為10、25、50 mg /kg；西藥組給予孟魯司特1.0 mg/kg[12]。將除正常對照組以外其余各組的大鼠全部放進(jìn)煙熏箱中，12只/箱，用透明膠帶，將2只大號漏勺的凹面朝內(nèi)進(jìn)行固定(注意：盡量不要遮住網(wǎng)眼)，放置香煙(第1次放8支，之后每次放10支)，再將香煙尾部用透明膠帶固定于漏勺的手柄位置，點(diǎn)燃香煙，將漏勺用筷子固定于煙熏箱頂部的活動門位置，隨后關(guān)閉活動門，箱內(nèi)大鼠被動吸煙，30 min/次[13]。造模周期共計52 d，第2～8天、第23～24天、第26～28天對各組大鼠均不做處理，以便大鼠體力恢復(fù)。其中，煙熏分為3階段：第1階段，每天煙熏1次(第9～22天和第29～36天)；第2階段，每天煙熏2次(第37～44 天)；第3階段，每天煙熏3次(第45～52天)，煙熏時間、次數(shù)總計： 22 d每天1次，8 d每天2次，8 d每天3次。脂多糖氣道注射總計2次，分別為第1、25天，脂多糖注射具體步驟如下：先用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，隨后仰位固定大鼠、備皮、消毒、沿縱向切開頸部皮膚、分離皮下的組織、將氣管暴露，四號針頭進(jìn)行氣管穿刺，緩慢注射0.1%的脂多糖200 μl。注射完畢后，立馬直立大鼠，將其左右旋轉(zhuǎn)，以促使脂多糖可于肺中進(jìn)行均勻的分布，完畢后進(jìn)行皮膚縫合、消毒，最后放在溫暖鼠籠中待其清醒，清醒后再將其放回原鼠籠中。正常對照組第1、25天分別氣道注射等值生理鹽水且不予被動吸煙。造模成功后，于第2天開始給予相應(yīng)藥物劑量進(jìn)行灌胃，其中正常對照組給予等值生理鹽水，1次/d，連續(xù)給藥30 d。

在處死大鼠前，觀察并記錄各組大鼠毛發(fā)狀況、精神狀態(tài)等相關(guān)情況，并計算大鼠的體質(zhì)量增長量，體質(zhì)量增長量=處死前體質(zhì)量-初始體質(zhì)量。應(yīng)用肺功能檢測儀測定各組大鼠肺功能相關(guān)指標(biāo)，肺順應(yīng)性(lungcompliance, CL)、第0.3秒的用力呼氣容積(forced expiratory volume 0.3%, FEV 0.3%)與用力肺活量(forced vital capacity, FVC)的比值、用力呼氣流量(maximum midexpiratory flow, MMEF)。

取各組的肺組織，分別提取其總蛋白，采用聚丙烯酰胺凝膠(10%)進(jìn)行電泳，結(jié)合說明書，進(jìn)行試驗(yàn)，檢測TLR2和NF-κB的表達(dá)，最后采用ECL試劑盒進(jìn)行顯影、成像[14]。每組實(shí)驗(yàn)均需重復(fù)3次。

按照ELISA試劑盒中說明書指示的相關(guān)操作步驟進(jìn)行，分別檢測血清和肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)中IL-1、IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α的表達(dá)水平；肺組織中相關(guān)指標(biāo)的測定，先離心、得到上清液后，再按照試劑盒步驟進(jìn)行檢測。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、各組大鼠的一般情況

正常對照組大鼠毛發(fā)光滑且白皙，活動正常，精神狀態(tài)較好，飲食較好，無咳嗽；COPD模型組大鼠毛發(fā)干燥且泛黃，活動較差，精神萎靡，飲食量減少，經(jīng)常性咳嗽；給藥組能明顯改善COPD模型組大鼠的上述不良情況。

二、各組大鼠體質(zhì)量增長情況

正常對照組大鼠體質(zhì)量增長(82.11±8.47)情況較好，模型組大鼠體質(zhì)量增長(43.22±5.35)明顯欠佳，與模型組相比，給藥組大鼠的增長情況有明顯地改善(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量增長情況

注：aP<0.05；bP<0.01，與模型組比較；cP<0.01，與正常對照組比較

三、各組大鼠肺功能情況

與正常對照組相比，模型組大鼠CL、FEV0.3%/FVC、MMEF均明顯下降(P<0.05)；與模型組相比，給藥組大鼠3項指標(biāo)均明顯升高(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠肺功能情況

注：aP<0.05；bP<0.01，與模型組比較；cP<0.01，與正常對照組比較

四、各組大鼠TLR2、NF-κB表達(dá)情況

與正常對照組相比，模型組大鼠TLR2、NF-κB表達(dá)水平均增加(P<0.05)；與模型組相比，給藥組大鼠可抑制其表達(dá)(P<0.05)，見表3，圖1。

表3 各組大鼠肺組織TLR2、NF-κB蛋白表達(dá)情況

注：aP<0.05；bP<0.01，與模型組比較；cP<0.01，與正常對照組比較

五、各組大鼠炎癥細(xì)胞因子表達(dá)情況

與正常對照組相比，模型組大鼠IL-1、IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α均明顯增加(P<0.05)；與模型組相比，給藥組大鼠這幾項炎癥因子均明顯減少(P<0.05)，見表4。

與正常對照組相比，模型組大鼠IL-1、IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α均明顯增加(P<0.05)；與模型組相比，給藥組大鼠上述幾項炎癥因子均明顯減少(P<0.05)，見表5。

圖1 各組大鼠TLR2和NF-κB表達(dá)的wb圖

與正常對照組相比，模型組大鼠IL-1、IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α均明顯增加(P<0.05)；與模型組相比，給藥組大鼠上述幾項炎癥因子均明顯減少(P<0.05)，見表6。

表4 各組大鼠血清中炎癥細(xì)胞因子表達(dá)情況

注：aP<0.05；bP<0.01，與模型組比較；cP<0.01，與正常對照組比較

表5 各組大鼠BALF中炎癥細(xì)胞因子表達(dá)情況

注：aP<0.05；bP<0.01，與模型組比較；cP<0.01，與正常對照組比較

表6 各組大鼠肺組織中炎癥細(xì)胞因子表達(dá)情況

注：aP<0.05；bP<0.01，與模型組比較；cP<0.01，與正常對照組比較

討 論

COPD是呼吸內(nèi)科的常見疾病，可直接對患者肺部功能造成影響，造成患者發(fā)生咳嗽、氣短、咳痰等臨床癥狀，進(jìn)而累計全身，造成病情反反復(fù)復(fù)，引起肺功能的不斷惡化，逐漸合并各種心肺等相關(guān)并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，威脅人類的健康[15-16]。COPD具有起病較緩慢、病程較長、病情重等特點(diǎn)，若不及時干預(yù)或干預(yù)不當(dāng)，將誘發(fā)全身性炎癥，伴隨全身各大靶器官的損傷，極易導(dǎo)致呼吸衰竭等。由于COPD的高患病率及高致死率，給家庭和社會造成巨大的負(fù)擔(dān)，預(yù)計到2020年，COPD將成為位居于世界疾病所造成經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)排名的第五位，且現(xiàn)COPD發(fā)病率正呈逐年上升趨勢，情況不容樂觀[17]。目前，COPD，這種以氣流被阻塞為特點(diǎn)的慢性支氣管炎及肺氣腫，其發(fā)病機(jī)制尚不完全明了，研究表明COPD是由多種炎癥細(xì)胞、因子一起參與的慢性氣管炎癥性疾病[18-19]。現(xiàn)今普遍認(rèn)為氣道、肺血管及肺實(shí)質(zhì)的慢性炎癥是COPD的特征性病理學(xué)改變，在COPD的發(fā)病中有著重要的意義。巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等激活后，可加速釋放IL-8、TNF-α等多種炎癥因子，其中，IL-1β和TNF-α作為眾多炎癥因子中較為重要的炎癥介質(zhì)前因子，可刺激IL-1、IL-6、IL-8等其他炎性介質(zhì)的分泌，這些炎癥遞質(zhì)可形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，進(jìn)一步不斷刺激分泌性的炎癥介質(zhì)滲出、中性粒細(xì)胞溶酶體的釋放和氧自由基的生成，再反饋的促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞釋放TNF-α和IL-1等，而TNF-α在氣道炎癥形成時，可加速中性粒細(xì)胞活化的進(jìn)程，導(dǎo)致大量中性粒細(xì)胞沉積于氣道黏膜，進(jìn)而促使肺組織中的炎癥細(xì)胞發(fā)生聚集、浸潤，并造成在肺組織內(nèi)損傷和修復(fù)不斷反復(fù)地交替進(jìn)行，導(dǎo)致氣流不可逆性受限及肺泡壁損壞、肺組織纖維化及氣道結(jié)構(gòu)發(fā)生重塑[20-21]。此外，TNF-α的過度表達(dá)也會導(dǎo)致炎癥反應(yīng)發(fā)生時，患者肺組織損毀的進(jìn)一步加重[22]。而IL-1β、IL-1、IL-6、IL-8等指標(biāo)，特別是IL-1β是在炎癥的初始到炎癥的持續(xù)進(jìn)程中都存在的炎性細(xì)胞因子。研究發(fā)現(xiàn)，氣道中IL-1β也可反映患者氣道中是否存在固有炎癥，且IL-1β的表達(dá)在COPD的穩(wěn)定期及急性加重期表達(dá)更多[23]。同時，有研究顯示，IL-1β在COPD患者中表達(dá)增加也是造成患者病情進(jìn)一步加重的原因之一[24]。故想要緩解COPD癥狀，延緩COPD的進(jìn)程，抑制炎癥因子的釋放現(xiàn)已成為研究的熱點(diǎn)和方向。

TLRs作為一類新近發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞表面受體，可感知病原體并可激活細(xì)胞從而產(chǎn)生非特異性免疫，它也是連接非特異性和特異性免疫的紐帶[25]。當(dāng)微生物突破機(jī)體的屏障時，TLRs可以識別微生物，并激活機(jī)體，產(chǎn)生免疫應(yīng)答。同時，在調(diào)控炎癥反應(yīng)方面，TLRs信號通路的作用也是受到公認(rèn)的。TLRs受到刺激后，可活化干擾素通路、NF-κB通路等。NF-κB作為免疫應(yīng)答中重要的蛋白調(diào)節(jié)因子，也有著非常重要的作用。

關(guān)于COPD的防治方式多種多樣，對于COPD的急性期，主要使用支氣管擴(kuò)張劑、抗生素和全身使用糖皮質(zhì)激素等進(jìn)行治療，而穩(wěn)定期的患者則采取長期使用支氣管擴(kuò)張劑和糖皮質(zhì)激素吸入進(jìn)行維持治療，但臨床提示效果不是很滿意。然而，相對于現(xiàn)代西醫(yī)西藥治療而言，中醫(yī)藥療效較為突出，有一定的優(yōu)勢。目前雖然對于COPD有不少中醫(yī)藥相關(guān)研究，但大多深度不夠，僅局限于探討下游零散的相關(guān)因子，對機(jī)制研究甚少[26]。芍藥屬于芍藥科植物，主要存在于溫帶地區(qū)，是我國主要的藥材之一，主要的活性成分包括單貼苷類、鞣質(zhì)、酚類和一些黃酮、酸、烷、揮發(fā)油、氨基酸、蛋白質(zhì)等化合物，這些有效成分主要存在于芍藥苷中，其藥理作用多種多樣，應(yīng)用也比較廣泛。現(xiàn)中醫(yī)藥大量研究已證明芍藥苷具有抗炎、抗氧化等藥理學(xué)作用，但以往關(guān)于芍藥苷抗炎的研究主要涉及頸椎間盤、腎組織、腦組織等，也有對狼瘡小鼠肺損傷保護(hù)作用的研究，但對COPD的研究卻是一片空白。本實(shí)驗(yàn)采用煙熏+氣管內(nèi)給予LPS的方法建立大鼠COPD模型，以芍藥苷作為研究藥物，進(jìn)行了一系列初步探索。通過觀察大鼠一般情況、測定肺功能，發(fā)現(xiàn)芍藥苷可改善COPD大鼠毛發(fā)干燥、活動較差、精神萎靡、飲食量減少、經(jīng)常性咳嗽、體質(zhì)量增長欠佳等一般情況，還可提升大鼠肺順應(yīng)性(CL)、第0.3秒的用力呼氣容積和(FEV 0.3%)和用力肺活量(FVC)的比值、用力呼氣流量(MMEF)，從而改善COPD大鼠的肺功能，對COPD大鼠肺功能具有一定的作用；同時，通過ELISA法檢測血清、肺泡灌洗液和肺組織中IL-1、IL-6、IL-8等炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，結(jié)果與正常對照組相比，模型組大鼠IL-1、IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α均明顯增加(P<0.05)，與模型組相比，給藥組大鼠這幾項炎癥因子均明顯減少，說明芍藥苷可緩解炎癥因子的釋放；通過Western blot檢測肺組織中TLR2和NF-κB的表達(dá)，結(jié)果與正常對照組相比，模型組大鼠TLR2、NF-κB表達(dá)水平均增加(P<0.05)，與模型組相比，給藥組大鼠可抑制其表達(dá)，說明芍藥苷可抑制兩者的表達(dá)。通過以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測，芍藥苷對COPD的作用可能是調(diào)控TLR2/NF-κB的通路。從而抑制下游炎癥因子釋放引起的。這為治療COPD提供了新的思路。但本實(shí)驗(yàn)研究也存在一定的不足，影響下游炎癥因子的通路很多，不止這一條，本實(shí)驗(yàn)只能初步說明芍藥苷對TLR2/NF-kB通路可能會有影響，故在后續(xù)研究中，尚需加入通路相關(guān)拮抗劑作進(jìn)一步深入研究。