LHA-VTA Orexin-A通路對大鼠胃牽張敏感神經元放電活動和胃功能的調控研究

宗勇　劉瀟檸　金婷婷　孫向榮　欒曉　高勝利　郭菲菲

【摘要】 目的：觀察下丘腦外側核（LHA）-中腦腹側被蓋區（VTA）Orexin-A通路對大鼠胃牽張敏感神經元放電活動和胃排空的影響。方法：大鼠經VTA給予Orexin-A，采用單細胞外放電記錄方法，觀察VTA內胃牽張敏感神經元放電活動;酚紅定量法測定大鼠胃排空，并觀察電刺激下丘腦外側核后，VTA內Orexin-A反應性胃牽張敏感神經元放電活動及大鼠胃排空的變化。結果：電生理記錄到58個胃牽張敏感VTA神經元（GD），胃擴張后呈現興奮效應（GD-E）41個，呈現抑制效應（GD-I）17個。VTA微量注射Orexin-A，41個GD-E中，68.29%的神經元放電頻率顯著升高（P<0.05），而17個GD-I中，70.59%的神經元放電頻率顯著增加（P<0.05）。VTA預先注射Orexin1型受體拮抗劑SB-334867，則Orexin-A對胃牽張敏感神經元的作用被完全阻斷（P>0.05）。電刺激LHA，在VTA記錄到31個Orexin-A反應性GD-E神經元，其中有70.97%神經元進一步呈現興奮效應（P<0.05）;在VTA記錄到的17個Orexin-A反應性GD-I神經元，其中有64.71%神經元放電頻率顯著升高（P<0.05）。SB-334867預處理VTA可抑制電刺激LHA的作用（P<0.05）。胃排空研究結果顯示，VTA內微量注射Orexin-A和電刺激LHA，大鼠胃排空均顯著增加（P<0.05），VTA預先微量注射SB-334867，可阻斷該效應（P<0.05）。結論：下丘腦LHA-VTA存在Orexin-A功能通路，該通路可能參與胃功能的調控。

【關鍵詞】 Orexin-A; 下丘腦外側核-中腦腹側被蓋區通路; 胃牽張敏感神經元; 胃排空

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2019.26.002 文獻標識碼 A 文章編號 1674-6805（2019）26-000-04

Regulation of LHA-VTA Orexin-A Pathway on Discharge Activity of Gastric Distension Responsive Neurons and Gastric Emptying in Rats/ZONG Yong，LIU Xiaoning，JIN Tingting，et al.//Chinese and Foreign Medical Research，2019，17（26）：-6

【Abstract】 Objective：To observe the effect of Orexin-A pathway from lateral hypothalamic nucleus（LHA） to ventral tegmental area（VTA） on the discharge activity of gastric distension（GD） responsive neurons and gastric emptying in rats.Method：Extracellular discharges of single unit neuron was used to observe the discharge activity of GD-responsive neurons in VTA.Phenol red quantitative method was used to measure the gastric emptying in rats.The changes of the discharge activity of GD-responsive neurons in VTA and the gastric emptying in rats were observed after VTA Orexin-A administration or LHA electrical stimulation.

Result：Electrophysiological study showed that 58 GD were recorded in the VTA，of which 41 showed excitatory effects（GD-E） and 17 showed inhibitory effects（GD-I）.Out of the 41 GD-E neurons，the discharge frequency of 68.29% was significantly increased（P<0.05）.Out of GD-I neurons，the discharge frequency of 70.59% was significantly rised（P<0.05）.After preadministration of Orexin-A receptor antagonist SB334867 into VTA，the effect of Orexin-A on GD sensitive neurons was completely blocked（P>0.05）.31 Orexin-A reactive GD-E neurons in VTA were recorded after electrical stimulation of LHA，of which 70.97% neurons showed further excitatory effects（P<0.05）;in orexin-A sensitive GD-I neurons，the discharge frequency of 64.71% neurons were significantly rised（P<0.05）.Orexin-A receptor antagonist SB-334867 could inhibit the effects（P<0.05）.The gastric emptying of rats was significantly increased by microinjection of Orexin-A in VTA（P<0.05） or electrical stimulation of LHA（P<0.05）.Pre-microinjection of SB-334867 into VTA could block the effects（P<0.05）.Conclusion：There is an Orexin-A pathway between LHA-VTA，which may be involved in the regulation of gastric function.

【Key words】 Orexin-A; LHA-VTA pathway; Gastric distension-sensitive neurons; Gastric emptying

First-authors address：School of Basic Medicine，Qingdao University，Qingdao 266071，China

下丘腦包含室旁核（PVN）、弓狀核（ARC）、腹內側核（VMH）、背內側核（DMH）和外側區（LHA）等，主要通過協調行為、代謝和神經內分泌反應等發揮作用[1]。下丘腦LHA因損傷后動物模型出現攝食量下降和致死性的昏睡，一直被認為是“饑餓中樞”和重要的覺醒核團，且是中樞少數幾個表達神經肽Orexin的核團之一[2-3]。Orexin主要作用是促進攝食和維持覺醒狀態，包括Orexin-A和Orexin-B兩種亞型，其受體為Orexin 1型和2型，在中樞廣泛分布，Orexin神經元軸突在整個大腦中廣泛投射，有廣泛而復雜的功能[4-5]。

VTA是中腦邊緣多巴胺系統的核心腦區，在成癮藥物，如嗎啡作用下，VTA內多巴胺（DA）神經元被激活，使伏隔核（NAc）內DA水平顯著升高，這是成癮藥物發揮獎賞和強化效應及成癮行為建立的重要神經基礎[6]。進一步動物實驗發現，VTA、NAc和LC等成癮和獎賞行為反應有關核團內存在Orexin神經投射纖維[7]，且VTA注射Orexin激活VTA多巴胺能神經元，增強由食物或藥物引發的獎賞行為[8-10]。

本研究應用神經元單細胞外放電方法記錄電刺激LHA對VTA神經元放電頻率，通過胃排空變化觀察VTA在Orexin調控攝食中的作用，從而能夠對LHA表達Orexin作用和VTA在攝食、代謝和獎賞成癮間相互調控作用有進一步認識，為肥胖和成癮治療提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

Sprague-Dawley（SD）健康大鼠，成年雄性，體重200～250 g，標準飼料，飲水進食無限制。動物實驗前適應性飼養1周。按照《青島大學實驗動物保護和使用管理辦法》要求進行所有動物實驗。細胞外放電記錄共用大鼠90只，其中VTA注射Orexin-A后用50只，電刺激LHA后用40只。大鼠胃排空共用48只，其中VTA注射Orexin-A后用24只，隨機分為三組（n=8）：生理鹽水組、Orexin-A組、SB334867+Orexin-A組;電刺激LHA后用24只，隨機分為三組（n=8）：假電刺激組（SS）、電刺激組（ES）、SB334867+ES組。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物麻醉 大鼠禁食18 h后，腹腔注射水合氯醛麻醉（10%，300 mg/kg）。實驗過程中根據動物反應程度酌情注射水合氯醛維持麻醉狀態，每次低于首劑量的1/3。

1.2.2 胃部手術 分離大鼠胃部，胃大彎側切開胃腔，長約

1 cm，開口處放入胃擴張球囊，球囊接聚乙烯軟管到電子恒壓器，縫合胃部切口。再結扎胃幽門與十二指腸結合部，避免十二指腸反流。最后縫合腹部切口。為模擬胃部攝食擴張，由電子恒壓器注射3～5 ml生理鹽水進入胃內球囊，持續20 s，間隔4 min，共2 h[11]。

1.2.3 VTA埋管術 空腹大鼠麻醉后固定于恒溫腦立體定位儀。參照Paxinos大鼠腦解剖圖譜[12]，按VTA（前囟后5.6～6 mm，正中線旁開0.5～1 mm，顱骨下8～9 mm）定位用牙科鉆在顱骨開口，將不銹鋼套管（29 G）緩慢插入VTA，用牙托粉固定，縫合頭皮。術后7 d，每日腹腔注射青霉素8萬單位。

1.2.4 玻璃微電極制備 按要求（尖端直徑約3～10 μm，電極阻抗5～20 MΩ）制備四管玻璃微電極[13]，1號管灌注0.2%滂胺天藍（pH 7.7），滂胺天藍內插入銀電極絲，傳導電流信號至電生理記錄儀;2、3和4號管分別用于注射Orexin-A溶液、SB-334867溶液或0.5 mol/L氯化鈉溶液。

1.2.5 細胞外放電記錄 記錄前，監聽器和記錄儀所示波形判斷玻璃微電極的尖端進入空氣與瓊脂界面，再用微量推進器緩慢將微電極送至監測核團。探尋、記錄穩定的細胞外放電神經元，并鑒別其是否為胃擴張敏感神經元。壓力注射儀經2、3、4管將干預藥物分別注射于細胞表面，壓力：3.0～35.0 psi，給藥時間：100～1 500 ms/次，重復次數：2～5次[14]。神經元放電信號經放大器后輸入記錄儀，POWERLAB生物信號處理軟件分析神經元放電頻率變化。

1.2.6 電刺激伏隔核 空腹大鼠麻醉后固定于腦立體定位儀。參照Paxinos大鼠腦解剖圖譜，將刺激電極插入LHA（前囟后5.6～6 mm，正中線旁開0.5～1 mm，顱骨下8～9 mm），連接至電刺激器，設定參數：波寬0.5 ms，強度20 μA，頻率50 Hz，持續時間10 s[15]。實驗后，多聚甲醛灌注固定，取腦行冠狀切片，HE染色觀察電極位置，電極位于LHA內數據計入統計。

1.2.7 胃排空實驗 1.5 ml的酚紅注入空腹大鼠胃內。20 min后，處死大鼠，分離幽門和賁門，分別結扎后取下完整胃部。胃大彎側剖開胃體，內容物全部倒入100 ml NaOH溶液（0.1 N）中，緩慢攪勻后置于室溫1 h。5 ml待測液上清與0.5 ml三氯乙酸（20%）混勻后離心（3 000 r/min，20 min）。離心后取1 ml上清液與4 ml NaOH溶液（0.5 N）充分混合，測量混合液對560 nm光的吸收值。胃排空率計算公式如下：胃排空率（%）=（1-酚紅灌胃20 min后吸收值/酚紅標準吸收值）×100%。

1.3 統計學處理

應用SPSS 17.0對數據統計分析，數據以（x±s）表示。多樣本均數比較采用單因素方差分析，兩組間樣本均數比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Orexin-A對中腦腹側被蓋區胃牽張敏感神經元放電活動的影響

本實驗共用大鼠50只，在VTA內共記錄到58個胃牽張敏感神經元（GD），其中有41個神經元放電頻率從（5.65±1.27）Hz增大至（7.73±2.33）Hz（P<0.05），為胃牽張興奮性神經元（GD-E）。有17個神經元放電頻率從（5.78±0.97）Hz減小至（3.42±0.56）Hz（P<0.05），為胃牽張抑制性神經元（GD-I）。

VTA經四管玻璃微電極微量注射Orexin-A，41個GD-E神經元中，有28個神經元（28/41，68.29%）放電頻率從（6.14±1.22）Hz升高到（9.21±1.43）Hz（圖1 A），有9個神經元（9/41，21.95%）放電頻率從（6.87±1.46）Hz降低到（4.13±1.12）Hz，差異有統計學意義（P<0.05），其余4個神經元（4/41，9.76%）注射Orexin-A后放電頻率無顯著變化（P>0.05）。Orexin1型受體拮抗劑SB334867預處理VTA，可阻斷Orexin-A對GD神經元的作用（P<0.05，圖1A）。

GD-I神經元中，Orexin-A刺激12個神經元（12/17，70.59%）放電頻率從（6.03±1.42）Hz升高到（9.22±1.90）Hz（P<0.05;圖1B），4個神經元（4/17，23.53%）放電頻率被抑制，從（6.23±1.01）Hz下降到（3.12±0.92）Hz（P<0.05），1個神經元（1/17，23.53%）對Orexin-A無明顯反應（P>0.05）。VTA中預先注射SB334867，可阻斷Orexin-A對GD神經元的影響（P<0.05，圖1B）。生理鹽水對VTA中GD神經元放電頻率無影響（P>0.05）。

圖1 中腦腹側被蓋區中微量注射Orexin-A對大鼠胃牽張敏感神經元的影響

注：A為GD-E神經元;B為GD-I神經元。

2.2 電刺激下丘腦LHA對VTA內Orexin-A反應性胃牽張敏感神經元放電活動的影響

本組共用40只大鼠，在VTA中鑒別出43個GD-E神經元，26個GD-I 神經元。Orexin-A刺激31個GD-E神經元（31/43，72.09%）和17個GD-I神經元（11/17，64.71%）放電頻率升高。

上述31個GD-E神經元中，22個（22/31，70.97%）放電頻率在電刺激LHA時加快，從（6.41±1.98）Hz升高至（12.55±3.35）Hz（P<0.05，圖2A），6個（6/31，19.35%）放電頻率減慢[（6.15±2.06）Hz vs （3.49±1.27）Hz，P<0.05，圖2A]，其余3個（3/31，9.68%）神經元放電頻率無明顯變化（P<0.05，圖2A）。

17個可被Orexin-A激活的GD-I神經元中，11個神經元（11/17，64.71%）在電刺激LHA時出現興奮狀態，放電頻率升高[（6.28±1.28）Hz vs （9.65±2.29）Hz，P<0.01，圖2B]，5個（5/17，29.41%）神經元放電頻率受抑制[（6.91±1.78）Hz vs （4.02±1.06）Hz，

P<0.05]，1個（1/17，5.88%）神經元的放電頻率無顯著變化（P>0.05）。

進一步研究電刺激LHA對VTA中GD神經元調控作用是否通過orexin遞質通路，VTA中預先注射SB334867降低電刺激LHA對VTA內GD-神經元放電頻率的作用（P<0.05，圖2A、2B）。VTA內單獨注射SB334867，GD-E神經元和GD-I神經元放電頻率均未出現顯著改變（P>0.05，圖2A、2B）。

圖2 VTA微量注射Orexin-A對大鼠GD神經元放電頻率的影響

注：A為GD-E神經元;B為GD-I神經元。

2.3 VTA微量注射Orexin-A對大鼠胃排空的影響

VTA微量注射Orexin-A后，Orexin-A組大鼠20 min胃排空率與生理鹽水組相比顯著增加[（94.4±3.9）% vs （78.2±16.7）%，P<0.05，圖3]。SB334867預處理VTA顯著降低Orexin-A引起的大鼠胃排空增加[（81.2±4.2）%，P<0.05]。

圖3 中腦腹側被蓋區微量注射Orexin-A對大鼠胃排空的影響

*與生理鹽水組相比，P<0.05;#與SB334867+Orexin-A組比較，P<0.05。

2.4 電刺激下丘腦LHA對胃排空的影響

與VTA中注射Orexin-A類似，LHA電刺激促進胃排空。電刺激LHA（50 mA）20 min后，胃排空率較假電刺激組增加[（74.67±4.76）% vs （60.79±3.98）%，圖4]，與假電刺激組相比，差異有統計學意義（P<0.05）。電刺激LHA前VTA中注射SB334867（6 μg），電刺激LHA增加胃排空的作用減輕，排空率為（63.56±2.54）%，與LHA電刺激組相比，差異有統計學意義（P<0.05）。以上結果提示LHA可通過VTA調控胃排空，且LHA和VTA間Orexin-A神經通路發揮重要作用。

3 討論

本研究發現，Orexin-A刺激VTA中胃牽張敏感神經元放電頻率變化，電刺激下丘腦LHA區域也影響VTA中胃牽張敏感神經元放電頻率，Orexin1型受體拮抗劑SB334867可阻斷此作用;胃排空實驗結果顯示VTA注射Orexin-A和電刺激LHA均增加胃運動，且SB334867預處理后胃運動無顯著增加。

本實驗結果顯示，VTA內胃牽張敏感神經元在Orexin-A刺激后放電頻率發生變化，興奮性部分增加，部分降低或無反應，提示VTA內胃牽張敏感神經元大部分表達Orexin-A受體。關于Orexin-A在VTA內作用機制，Borgland等[16-17]發現急性應用Orexin-A能夠通過PKC/PLC信號通路劑量依賴性增加NMDA受體后興奮性突觸后電位，但對AMPA受體后興奮性突觸后電位無作用。Chiou等[18]還發現Orexin-A激活Gq/11偶聯的PLC-DAGL通路，再通過2-花生酰甘油三酯（2-AG）逆行抑制GABA產生和釋放。本實驗電刺激LHA后，VTA部分神經元放電頻率發生變化，說明LHA與VTA間存在信號傳遞，且1型受體拮抗劑SB334867預處理能夠抑制此影響，進一步表明LHA內部分Orexin-A沿神經元軸突纖維投射至VTA發揮作用。

既然VTA內胃運動相關的神經元對Orexin-A有反應，那么Orexin-A在VTA內是否參與胃運動的調控，LHA到VTA的神經元投射又有什么功能？本實驗觀察VTA內注射Orexin-A促進大鼠胃排空，與Orexin-A外周或中樞DMN內注射作用一致。電刺激LHA后胃排空增強，且SB334867預處理阻斷其作用，提示電刺激LHA后促進其表達Orexin-A，經軸突傳遞至VTA后具有一定生理功能。VTA由DA、GABA和谷氨酸（GLU）釋放神經元組成，其中DA神經元最豐富，而GABA和GLU神經元分別占總數的35%和2%～5%[19]。因VTA無直接神經元投射至胃部，故推測Orexin-A刺激VTA興奮后，通過GABA或多巴胺（DA）等遞質直接或間接影響DMN等迷走神經核團，再發揮調控胃排空作用。

本實驗通過電生理學和胃排空變化，觀察LHA經Orexin-A遞質對VTA神經元放電調控及對胃排空的促進作用，完善了生理條件下LHA與VTA間Orexin遞質作用，為進一步研究Orexin在調控VTA有關的獎賞性攝食和非生理性攝食提供新的研究思路，為肥胖和成癮治療提供新的理論基礎。

參考文獻

[1] Cakir I，Nillni E A.Endoplasmic reticulum stress，the hypothalamus，and energy balance[J].Trends Endocrinol Metab，2019，30（3）：163-176.

[2] Mobbs C V.Orphaned no more？Glucose-sensing hypothalamic neurons control insulin secretion[J].Diabetes，2016，65（9）：2473-2475.

[3] Ono D，Yamanaka A.Hypothalamic regulation of the sleep/wake cycle[J].Neurosci Res，2017，118：74-81.

[4] Peyron C，Tighe D K，Van den Pol A N，et al.Neurons containing hypocretin（orexin） project to multiple neuronal systems[J].J Neurosci，1998，18（23）：9996-10015.

[5] Nambu T，Sakurai T，Mizukami K，et al.Distribution of orexin neurons in the adult rat brain[J].Brain Res，1999，827（1-2）：827.

[6] Morales M，Margolis E B.Ventral tegmental area：cellular heterogeneity，connectivity and behaviour[J].Nat Rev Neurosci，2017，18（2）：73-85.

[7] Fadel J，Deutch A Y.Anatomical substrates of orexin-dopamine interactions：lateral hypothalamic projections to the ventral tegmental area[J].Neuroscience，2002，111（2）：379-387.

[8] Korotkova T M，Sergeeva O A，Eriksson K S，et al.Excitation of ventral tegmental area dopaminergic and nondopaminergic neurons by orexins/hypocretins[J].J Neurosci，2003，23（1）：7-11.

[9] Boutrel B，Kenny P J，Specio S E，et al.Role for hypocretin in mediating stress-induced reinstatement of cocaine-seeking behavior[J].Proc Natl Acad Sci USA，2005，102（52）：19168-19173.

[10] Harris G C，Wimmer M，Aston-Jones G.A role for lateral hypothalamic orexin neurons in reward seeking[J].Nature，2005，437（7058）：556-559.

[11] Appia F，Ewart W R，Pittam B S，et al.Convergence of sensory information from abdominal viscera in the rat brain stem[J].Am J Physiol，1986，251（2 Pt 1）：G169-175.

[12] De Groot.The rat hypothalamus in stereotaxic coordinates[J].The Journal of Comparative Neurology，1959，113（3）：389-400.

[13] Li Z L，Xu L，Sun X R，et al.Central nesfatin-1 influences the excitability of ghrelin-responsive gastric distension neurons in the arcuate nucleus and reduces gastric motility in rats[J].Eur J Neurosci，2013，38（11）：3636-3643.

[14] Jhamandas J H，Lind R W，Renaud L P.Angiotensin II may mediate excitatory neurotransmission from the subfornical organ to the hypothalamic supraoptic nucleus：an anatomical and electrophysiological study in the rat[J].Brain Res，1989，487（1）：52-61.

[15] Avetisyan E A，Adamyan F A，Petrosyan A A.The role of the septal nuclei in controlling the activity of vagosensitive neurons in the solitary tract nucleus in cats[J].Neurosci Behav Physiol，2004，34（5）：473-478.

[16] Borgland S L，Taha S A，Sarti F，et al.Orexin A in the VTA is critical for the induction of synaptic plasticity and behavioral sensitization to cocaine[J].Neuron，2006，49（4）：589-601.

[17] Borgland S L，Storm E，Bonci A.Orexin B/hypocretin 2 increases glutamatergic transmission to ventral tegmental area neurons[J]Eur J Neurosci，2008，28（8）：1545-1556.

[18] Chiou L C，Tung L W，Lee Y S，et al.Orexin-endocannabinoid signaling in stress-induced cocaine relapse[C]//International Narcotic Research Conference，Cairns，Australia.2013.

[19] Taylor S R，Badurek S，Dileone R J，et al.GABAergic and glutamatergic efferents of the mouse ventral tegmental area[J].Journal of Comparative Neurology，2014，522（14）：3308-3334.

（收稿日期：2019-07-26） （本文編輯：何玉勤）

*基金項目：中國博士后科學基金項目

（項目編號：2018M632627;2018M630749）

山東省醫藥衛生科技發展計劃項目（項目編號：2018WS378）

①青島大學基礎醫學院 山東 青島 266071

②淄博市臨淄區婦幼保健院

通信作者：高勝利