基于EST-SSR熒光標記和毛細管電泳檢測技術分析邵武碎銅茶群體遺傳多樣性與親緣關系研究

楊 軍，孔祥瑞，王讓劍，邱麗玲，鄭國華，邱陳華

(1.福建省農業科學院茶葉研究所/國家茶樹改良中心福建分中心/農業部福建茶樹及烏龍茶加工科學觀測實驗站，福建 福州 350012；2.邵武農業農村局，福建 邵武 354000)

邵武碎銅茶又名“觀星茶”也叫“神仙茶”，為有性茶樹群體種，2009年入選為福建省農業農村廳認定的福建省茶樹優異種質資源保護區。其生長于福建省邵武市和平鎮海拔1000多米的留仙峰山上，生長環境多為亂石巖縫，制作成綠茶與紅茶品質風味獨特，取少量茶與古銅錢一起咀嚼2～3 min，能使銅錢軟化而破碎得名，被稱為世界兩大“奇茶”之一[1]。

近些年，EST-SSR分子標記因來自于功能基因，具有多態性高、共顯性、重復性好等特點，在資源鑒定與輔助育種中廣泛應用[2-5]。茶樹種質資源遺傳多樣性與親緣關系分析是野生茶樹種質初步鑒定的重要手段。近些年，利用分子標記技術分別對云南白鶯山茶樹種質資源[6]、貴陽花溪古茶樹資源[7]、黔南野生茶樹種質資源[8]、香竹簧茶樹王與野生茶樹種質資源[9]、貴州古茶樹種質資源[10]進行研究，結果表明云南白鶯山茶樹種質資源亞群間存在著基因交流；貴陽花溪古茶樹資源由喬木型向灌木型進化；黔南野生茶樹種質資源遺傳差異較大，遺傳基礎較寬；香竹簧茶樹王與野生茶樹、栽培型茶樹品種之問的遺傳關系較遠；由于遺傳因素和地理位置不同引起貴州古茶樹資源的遺傳多樣性高。本試驗對邵武碎銅茶群體進行個體材料的親緣關系與遺傳多樣性研究，旨在對邵武茶樹種質進行初步鑒定，為茶樹育種、雜交親本選配提供初步依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

參試的29份邵武碎銅茶來自于福建省邵武市和平鎮留仙峰。以40個福建省茶樹良種作為對照(表1)，對照樣品采自于福建省農業科學院茶葉研究所。采集各個材料一芽二葉鮮葉后用液氮迅速冷凍處理，保存在-70℃冰箱中備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 農藝性狀調查 農藝性狀調查參考陳亮等[11]撰寫的《茶樹種質資源描述規范和數據標準》。

表1 69份供試材料的名稱與來源

1.2.2 基因組DNA的提取 采用改進的CTAB法[12]提取茶樹基因組DNA。用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳進行茶樹基因組分子量大小檢測，用756-MC型紫外分光光度計測定茶樹基因組DNA的純度(OD260/280比值)。

1.2.3 引物合成 參照文獻[13]引物序列，序列由上海Sangon公司合成，引物信息見表2。

1.2.4 PCR擴增和產物鑒定 PCR 反應體系為：ddH2O18.8 μL，10×Buffer2.5 μL(Mg2+)，dNTP(10 mmol·L-1)0.5 μL，上、下游primer(10 μmol·L-1)各0.5 μL，Taq polymerase 0.2 μL(0.5 U)，模板DNA 1 μL。PCR反應于美國ABI-9600型擴增儀上進行，熱循環程序為：94℃預變性4 min，然后進入下列溫度循環：94℃變性45 s，不同溫度條件退火60 s，72℃延伸75 s，重復35個熱循環；72℃延伸10 min，最后4℃保存。

引物統一在反向引物(R)的5′段標記熒光(FAM/TAMRA)，由上海百力格生物科技有限公司合成。擴增產物0.5 μL，GeneScanTM500 ROXTM0.5 μL，HiDi 9 μL，混勻后使用ABI公司3730XL進行毛細管電泳。

1.2.5 數據處理 采用ABI公司的GeneMapper 4.0軟件，選擇GeneScanTM500 ROXTM作為分子量標準，對每一個擴增出的條帶記錄大小。運用PopGen 3.2軟件計算Shannon信息指數(I)和Nei’s基因多樣性指數(H)。運用NTSYSpc2.1中的Tree plot程序進行聚類分析。

表2 20對 SSR 引物及其序列

2 結果與分析

2.1 邵武碎銅茶葉片性狀初步調查

從表3中看出邵武碎銅茶種質資源，葉身多為平，葉片著生狀態為稍上斜與水平，葉面以微隆起為主，葉尖以漸尖為主；調查葉片長寬比值范圍在1.92～3.06，平均值為2.40，推測葉片以橢圓形為主，少量為長橢圓形；葉面積平均值為17.87 cm2，為小葉種，與當地種質資源描述為中葉種有所差異，葉面積大小受葉片調查代表性、調查時間與生長環境氣候變化相關，推測有性邵武碎銅茶種質資源群體為小葉種與中葉種并存。

2.2 親緣關系分析

從相似系數聚類圖1上看出，69個參試材料分為8個類群，除TY286、TY299、TY264外，其它邵武碎銅茶種質資源分布于類群A、B、C；D類群主要為閩東地區綠茶品種資源；E類群主要為黃棪、金牡丹等高香烏龍茶品種資源；F類群主要為閩北烏龍茶品種資源；G類群主要為閩南烏龍茶品種資源；H類群主要為福云系列綠茶品種資源。從整體上看，邵武碎銅茶種質資源與福建主要茶樹品種未聚類在一起，分為3個相對獨立的類群。與具有云南遺傳基礎的福云系列品種資源相比，邵武碎銅茶跟福建省品種資源親緣關系相對較近，說明本研究的親緣關系在一定程度上反映了不同群體資源間遺傳距離的遠近。同時，邵武碎銅茶種質資源具有獨特的遺傳背景。

表3 葉片性狀調查結果

注：農藝性狀調查時間為8月。

2.3 群體間遺傳多樣性比較分析

從表4中看出，A-H群體中Shannon遺傳多樣性指數最高的為B、C群體，推測在群體數量差不多情況下，邵武碎銅茶種質資源遺傳多樣性豐富；Shannon遺傳多樣性指數最低的為E、F群體。Hardy-Weinberg遺傳偏離指數D主要反映Ho(觀測雜合度)和He(期望雜合度)之間的平衡關系，D值越接近0，基因型的分布就越接近于平衡狀態，D值大于0說明存在雜合子過剩，D值小于0，說明存在雜合子缺失現象[14]。類群A、F、G的Ho與對應的He相當，說明這3個類群基因型的分布就越接近于平衡狀態；類群B、C、D、E、H 的Ho高于對應的He，D值大于0，雜合子過剩現象，尤其是類群H的D值最大，屬于親本單一，基本遺傳背景來自與福云系列；整體邵武碎銅茶種質資源的D值趨向0，說明邵武資源整體基因型的分布趨向平衡，群體相對穩定。

從群體聚類圖2看出，同屬邵武碎銅茶種質資源的類群A、B、C聚類在一起，群體遺傳背景相對一致；類群D、E、F、G聚類在一起，主要為福建審(鑒)定品種；H類群主要為福云系列綠茶品種資源，與其它福建茶樹種質資源親緣關系相對較遠，說明其云南種質資源遺傳基礎起到一定的作用。

圖1 遺傳相似系數聚類圖Fig.1 Dendrogram on genetic similarity

表4 對比11個群體遺傳多樣性

圖 2 群體遺傳相似系數聚類圖Fig. 2 Dendrogram on genetic similarity of various groups

3 討論

3.1 遺傳多樣性分析

茶樹種質資源Shannon多樣性指數是衡量茶樹種質資源遺傳多樣性的重要指標。91個云南千家寨不同海拔野生茶樹Shannon多樣性指數為1.33[15]；廣東歷史名茶群體種曲江羅坑茶與豐順馬圖茶Shannon多樣性指數分別為1.217與1.228[16]；38個湖南黃金茶Shannon多樣性指數為0.55[17]；福建地區茶樹資源Shannon多樣性指數為1.16[18]；122個云南野生茶樹Shannon多樣性指數為0.88[19]。本試驗計算29個邵武碎銅茶種質資源Shannon多樣性指數為1.1298，與前人研究相比，Shannon多樣性指數高于湖南黃金茶與122個云南野生茶樹，低于廣東歷史名茶與91個云南千家寨不同海拔野生茶樹，初步鑒定說明邵武碎銅茶種質資源的群體遺傳多態性高，多樣性豐富。

3.2 邵武碎銅茶親緣關系分析

29個邵武碎銅茶種質資源與參試對照福建審(鑒)定品種與地方品種均未聚類在一起，說明邵武碎銅茶與福建現有育成品種的遺傳背景差異較大，擁有相對獨立的遺傳背景，具有較強的育種潛力。除參試材料TY286、TY299、TY264外，邵武碎銅茶種質資源主要分為3個群體，每個群體的農藝性狀、生化成分、適制性茶類等需要進一步鑒定與觀察；參試材料整體聚類分析初步看出，人工選育品種多聚類在一起，比如類群E、H，地方品種多聚類在一起，比如類群D、G，同時，綠茶類型多聚類在一起，烏龍茶類型聚類在一起。