呋吡菌胺原藥高效液相色譜內標分析方法研究

李 婷，許艷秋,王廣成，陳丙坤，高立明，吳春先

(四川省農藥檢定所，四川 成都 610041)

呋吡菌胺(Furametpyr)CAS號為123572-88-3，分子式：C17H20ClN3O2，化學名稱：(RS)-5-氯-N-(1,3-二氫-1,1,3-三甲基異苯并呋喃-4-基)-1,3-二甲基吡唑-4-甲酰胺，是由日本住友化學株式會社開發的琥珀酸脫氫酶抑制劑(SDHI)類殺菌劑。呋吡菌胺具有內吸活性，且傳導性能優良，對擔子菌綱的大多數病菌具有活性，尤其是對絲核菌屬和伏革菌屬引起的植物病害，如水稻紋枯病、菌核病、白絹病等有特效[1]。

呋吡菌胺純品為無色或淺棕色固體，可溶于丙酮等有機溶劑，其結構式如下：

目前國內對呋吡菌胺的分析尚未見報道。本文首次采用高效液相色譜內標法對呋吡菌胺進行定性和定量分析。該方法操作簡便、準確，分離效果好，準確度和精密度均能達到定量分析的要求。

1 試驗部分

1.1 試劑與儀器 Waters 2695高效液相色譜儀，帶2996二極管陣列檢測器和Empower工作站；色譜柱：C18250mm×4.6mm；乙腈，HPLC級；乙酸，分析純；聯苯，分析純；呋吡菌胺標準品，質量分數99%(購于Dikma公司)；97%呋吡菌胺原藥(購于上海安譜實驗科技股份有限公司)。

1.2 色譜操作條件 流動相：乙腈+0.3%乙酸溶液=70+30(v/v)；流量：1.0mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：228nm；進樣體積：5μL；保留時間：呋吡菌胺約4.6min，內標聯苯約7.5min。

典型的標樣及呋吡菌胺原藥高效液相色譜圖(圖1、圖2)。

圖1 呋吡菌胺標樣和聯苯液相色譜圖

圖2 97%呋吡菌胺原藥和聯苯液相色譜圖

1.3 測定步驟

1.3.1 內標溶液的配制 稱取約0.5g(精確至0.000 2g)聯苯于100mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容，搖勻作為內標溶液備用。

1.3.2 標樣溶液的配制 稱取呋吡菌胺標樣約0.05g(精確至0.000 2g)于50mL容量瓶中，用移液管準確加入5.0mL內標溶液，用乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，超聲波5min，靜置至室溫，備用。

1.3.3 試樣溶液的配制 稱取97%呋吡菌胺原藥約0.06g(精確至0.000 2g)于50mL容量瓶中，用1.3.2中同一移液管準確加入5.0mL內標溶液，用乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，超聲波5min，靜置至室溫，備用。

1.3.3 測定 在上述色譜條件下，待儀器基線穩定，連續注入數針標樣溶液，直至相鄰2針呋吡菌胺的響應值相對變化<1.5%，按照標樣溶液、試樣溶液、試樣溶液、標樣溶液的順序進行測定。

1.3.4 計算 將測得的2針試樣溶液以及試樣前后2針標樣溶液呋吡菌胺峰面積和內標物峰面積的比值分別進行平均，試樣中呋吡菌胺的質量分數X(%)按下式計算：

式中：A1標樣溶液中，呋吡菌胺峰面積與內標峰面積比值的平均值；

A2試樣溶液中，呋吡菌胺峰面積與內標峰面積比值的平均值；

m1呋吡菌胺標樣的質量，g；

m2呋吡菌胺試樣的質量，g；

P標樣中呋吡菌胺的質量分數，%。

2 結果與討論

2.1 流動相的選擇 分別用不同比例的甲醇+水、乙腈+水、甲醇+0.3%乙酸水溶液、乙腈+0.3%乙酸水溶液作為流動相，對試樣進行分離檢測。試驗結果表明，當乙腈+0.3%乙酸水溶液作流動相時，呋吡菌胺和聯苯能達到有效分離，分離效果好，峰形對稱，保留時間適宜。因此選擇乙腈+0.3%乙酸水溶液作為樣品分離流動相條件。

2.2 內標溶液的選擇 通過對呋吡菌胺在上述色譜條件下不斷優化，對聯苯、對氯苯酚、磷酸三苯酯、鄰苯二甲酸丁酯等在相同色譜條件下的出峰情況以及吸收波長相比較，得到聯苯作為內標最為合適。

2.3 吸收波長的選擇 通過Waters 2996二極管陣列檢測器的光譜數據采集功能，獲得呋吡菌胺和內標物聯苯在190～400nm的吸收波長掃描圖(圖3)，呋吡菌胺在203、270nm有較好的吸收；聯苯在203、248nm有較強的吸收。兩者紫外吸收曲線在203、228、270nm處有交叉點，在波長203nm處有最大吸收，但受雜質影響較大；波長270nm處兩者的紫外吸收偏小；在波長228nm有較大吸收，且基線平穩，雜質吸收較小，主峰和雜質峰分離效果較好，峰高適中，故確定228nm為本分析方法的檢測波長。

圖3 呋吡菌胺與聯苯紫外吸收全掃描圖

2.4 分析方法的線性相關性 分別稱取呋吡菌胺標準品(0.026 4、0.040 9、0.053 6、0.064 7、0.100 8g)于50mL容量瓶中，準確加入聯苯內標溶液(28.02mg/5mL)5.0mL，用乙腈定容，配制成5個不同濃度的標樣溶液。在上述色譜操作條件下進行分析，以標準品溶液與內標物聯苯的質量比為橫坐標，呋吡菌胺與內標物聯苯的峰面積之比為縱坐標繪制標準曲線，得到呋吡菌胺的線性方程為y=0.507 7x+0.074 5，R2=0.999 4。

2.5 分析方法的精密度 從同一個97%呋吡菌胺中準確稱取5個試樣，在上述色譜操作條件下進行分析，測得呋吡菌胺含量為97.35%，標準偏差為0.12，變異系數為0.12%(表1)。

表1 分析方法的精密度試驗結果

2.6 分析方法的準確度 以已知含量為97%的呋吡菌胺原藥樣品為本底，分別加入一定量的呋吡菌胺標準品于50mL的容量瓶中，準確加入5.0mL內標溶液，用乙腈定容，在上述色譜條件下分析，測得呋吡菌胺的回收率為99.56%～101.10%，平均回收率為100.28%(表2)。

表2 分析方法的準確度試驗結果

3 結論

本文建立的97%呋吡菌胺原藥的高效液相色譜內標分析方法，準確度和精密度高，線性關系良好，具有簡便、快速、準確及分離效果好的特點，可作為呋吡菌胺質量檢測和質量控制的一種可行的、較理想的分析方法。