基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的虎杖治療結(jié)直腸癌作用機(jī)制研究

嚴(yán)卿瑩 葉曄 馮冠 郭凱波 阮善明 沈敏鶴

摘要：目的? 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析虎杖治療結(jié)直腸癌的藥理機(jī)制，為新藥研發(fā)提供參考。方法? 通過(guò)TTD、Dis數(shù)據(jù)庫(kù)提取結(jié)直腸癌的主要靶點(diǎn)，從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中提取虎杖的主要化學(xué)成分，以口服生物利用度（OB）≥30、藥物半衰期（HL）≥4 h、類(lèi)藥性（DL）≥0.18篩選活性成分，通過(guò)HIT、ChemMapper、STITCH數(shù)據(jù)庫(kù)提取活性成分主要靶點(diǎn)，采用Cytoscape3.2.1軟件構(gòu)建成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，并分析主要通路。結(jié)果? 經(jīng)篩選，共獲得9種主要活性成分，作用于56個(gè)靶點(diǎn)，其中核心靶點(diǎn)有ESR1、KRAS、TYMS、AKT1、PPARD、PTGS1、FNTB、PTGS2、PPARG、ALDH2、PDE5A等，主要作用于調(diào)控生長(zhǎng)因子及其受體信號(hào)通路、白細(xì)胞介素介導(dǎo)的信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡及生物氧化等多種信號(hào)通路。結(jié)論? 本研究初步揭示了虎杖治療結(jié)直腸癌的多成分、多靶點(diǎn)、多通路的作用機(jī)制，可為虎杖開(kāi)發(fā)利用提供參考。

關(guān)鍵詞：網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);虎杖;結(jié)直腸癌;活性成分

中圖分類(lèi)號(hào)：R285;R273.53? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? 文章編號(hào)：1005-5304（2019）04-0096-05

結(jié)直腸癌是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，隨著飲食結(jié)構(gòu)及生活習(xí)慣的改變，我國(guó)結(jié)直腸癌發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，在惡性腫瘤中發(fā)病率和病死率均分別居第4位和第5位[1]。

虎杖為蓼科植物虎杖Polygonum cuspidatum Sieb. Et Zucc.的干燥根莖，性微寒，味微苦，有利濕退黃、清熱解毒、散瘀止痛功效，其化學(xué)成分主要有蒽醌類(lèi)、二苯乙烯類(lèi)、黃酮類(lèi)等。虎杖具有抗炎、抗病毒、抗菌、調(diào)血脂、抗血栓、改變血流變、擴(kuò)張血管、抗氧化、抗腫瘤等作用[2]。研究表明，虎杖及其主要化學(xué)成分白藜蘆醇在結(jié)直腸癌的治療中發(fā)揮重要作用[3]。復(fù)方研究中，白藜蘆醇含量高的虎杖發(fā)揮著主導(dǎo)作用[4]。柏連松臨床治療結(jié)直腸癌以虎杖作為常用藥，療效顯著[5]。虎杖成分較多，抗結(jié)直腸癌的主要機(jī)制尚未明確。本研究主要篩選結(jié)直腸癌的潛在治療靶點(diǎn)，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)虎杖的主要活性成分進(jìn)行篩選，分析活性成分的作用靶點(diǎn)及生物通路，從而闡明虎杖治療結(jié)直腸癌可能的作用機(jī)制。

1? 資料與方法

1.1? 結(jié)直腸癌靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

以“colorectal cancer”為關(guān)鍵詞，挖掘TTD數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//db.idrblab.org/ttd/）及Dis數(shù)據(jù)庫(kù)（http：// www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu/home）中治療結(jié)直腸癌的潛在靶點(diǎn)。在Dis數(shù)據(jù)庫(kù)中，得分越高，表明該靶點(diǎn)與疾病的相關(guān)性越高。設(shè)定得分>0.01的目標(biāo)靶點(diǎn)為結(jié)直腸癌的潛在靶點(diǎn)。刪除2個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)間的重復(fù)靶點(diǎn)。為標(biāo)準(zhǔn)化靶點(diǎn)基因信息，將不同ID類(lèi)型轉(zhuǎn)換為Swiss-Prot號(hào)。

1.2? 化學(xué)成分收集與活性成分篩選

在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp. php）查找虎杖相關(guān)的分子信息及相應(yīng)的生物學(xué)測(cè)試，在此基礎(chǔ)上以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、藥物半衰期（half-life，HL）≥4 h、類(lèi)藥性（drug likeness，DL）≥0.18作為活性成分篩選條件。

1.3? 目標(biāo)靶點(diǎn)收集

已驗(yàn)證的靶點(diǎn)從HIT數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//lifecenter.sgst. cn/hit/）中提取，根據(jù)Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//pubchem. ncbi.nlm.nih.gov）中各活性成分的分子結(jié)構(gòu)圖，從ChemMapper（http：//lilab.ecust.edu.cn/chemmapper/）、STITCH數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//stitch.embl.de/）中獲得潛在的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。ChemMapper在線(xiàn)工具基于3D相似性預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，本研究設(shè)定各活性成分的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)參數(shù)為分子的3D相似性>0.85，且均來(lái)源于DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.4? 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

使用Cytoscape3.2.1軟件構(gòu)建成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。使用插件CentiScape分析網(wǎng)絡(luò)以計(jì)算拓?fù)鋮?shù)，包括自由度、介數(shù)。自由度越大，參與的生物功能越多，生物學(xué)重要性越強(qiáng);介數(shù)越大，表明節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中越重要。

1.5? 通路分析

通過(guò)Cytoscape插件，Reactome FI軟件進(jìn)一步分析虎杖治療結(jié)直腸癌預(yù)測(cè)靶點(diǎn)的相關(guān)通路。將相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入Reactome FI，設(shè)定P≤0.01，錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）≤0.01進(jìn)行通路分析。

2? 結(jié)果

2.1? 結(jié)直腸癌相關(guān)靶點(diǎn)基因

從TTD數(shù)據(jù)庫(kù)共獲得31個(gè)靶點(diǎn)基因，從Dis數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得2753個(gè)潛在靶點(diǎn)基因（其中得分>0.01的有124個(gè)靶點(diǎn)），刪除重復(fù)基因，共獲得150個(gè)可能與結(jié)直腸癌相關(guān)的靶點(diǎn)基因。

2.2? 虎杖化學(xué)成分及目標(biāo)靶點(diǎn)

從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中提取虎杖化學(xué)成分63種，經(jīng)篩選，獲得9種主要活性成分：木犀草素、槲皮素、β-谷甾醇、大黃素甲醚苷、大黃酸、Torachrysone- 8-O-beta-D-（6'-oxayl）-glucoside、6，8-Dihydroxy-7-methoxyxanthone、囊毒堿及鴨腳樹(shù)葉堿，見(jiàn)表1。

2.3? 活性成分驗(yàn)證靶點(diǎn)及預(yù)測(cè)靶點(diǎn)

各活性成分的目標(biāo)靶點(diǎn)見(jiàn)表2。其中HZ-1包含56個(gè)已驗(yàn)證靶點(diǎn)和357個(gè)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，HZ-2包含167個(gè)已驗(yàn)證靶點(diǎn)和564個(gè)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，HZ-3包含10個(gè)已驗(yàn)證靶點(diǎn)和1018個(gè)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。

2.4? 活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析及主要活性成分

構(gòu)建9種活性成分成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)由65個(gè)節(jié)點(diǎn)構(gòu)成，包括9個(gè)成分節(jié)點(diǎn)和56個(gè)目標(biāo)靶點(diǎn)，見(jiàn)圖1。

網(wǎng)絡(luò)分析表明，β-谷甾醇自由度為36，介數(shù)為0.435 28，預(yù)測(cè)為虎杖治療腫瘤中發(fā)揮的主要成分，其次為木犀草素（自由度為31、介數(shù)為0.435 28）、大黃酸（自由度為22、介數(shù)為0.108 20），見(jiàn)表3。

ESR1為9種活性成分共有的目標(biāo)靶點(diǎn)，因此我們認(rèn)為ESR1是虎杖治療結(jié)直腸癌的最主要靶點(diǎn)，KRAS、TYMS、AKT1、PPARD、PTGS1、FNTB、PTGS2、PPARG、ALDH2、PDE5A亦為相對(duì)重要靶點(diǎn)，見(jiàn)表4。

2.5? 基因功能及通路分析

應(yīng)用Reactome FI對(duì)虎杖治療結(jié)直腸癌相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行信號(hào)通路分析，根據(jù)設(shè)定，共富集到38條信號(hào)通路。相關(guān)靶點(diǎn)主要富集于免疫系統(tǒng)中的細(xì)胞因子信號(hào)、通用轉(zhuǎn)錄途徑、白細(xì)胞介素介導(dǎo)的信號(hào)通路、PI3K/AKT信號(hào)通路、B細(xì)胞受體介導(dǎo)的信號(hào)通路、EGFR信號(hào)通路、ERBB信號(hào)通路、TP53信號(hào)通路，同時(shí)與細(xì)胞凋亡、生物氧化、調(diào)節(jié)胰島素樣生長(zhǎng)因子、P21的轉(zhuǎn)錄激活等密切相關(guān)，見(jiàn)表5。

3? 討論

結(jié)直腸癌屬中醫(yī)學(xué)“癥瘕”“腸蕈”“積聚”等范疇，起病較為隱匿。目前化療仍為大部分轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的首選，盡管靶向藥物在一定程度上提高了客觀(guān)緩解率和總生存率，但多藥耐藥及不良反應(yīng)影響了療效及患者生存質(zhì)量。因此，中醫(yī)藥干預(yù)結(jié)直腸癌相關(guān)研究越來(lái)越受到重視。

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法初步篩選出虎杖治療結(jié)直腸癌的活性成分為β-谷甾醇、木犀草素和大黃酸。β-谷甾醇是存在于植物和蔬菜中的主要生物活性成分，可清除活性氧誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗氧化性，從而抑制結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展[6]。木犀草素是一種天然黃酮類(lèi)化合物，可抑制CREB1的轉(zhuǎn)錄，從而阻斷上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，發(fā)揮抗結(jié)直腸癌的作用[7]。大黃酸作為虎杖的重要成分，能逆轉(zhuǎn)卵巢癌中阿霉素多藥耐藥[8]，還可減輕惡病質(zhì)[9]。因此，虎杖治療結(jié)直腸癌主要通過(guò)β-谷甾醇、木犀草素和大黃酸發(fā)揮作用。

ESR1是結(jié)直腸癌發(fā)生、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中最重要的調(diào)節(jié)基因[10]，同時(shí)KRAS、TP53等可能在結(jié)直腸癌診斷中起關(guān)鍵作用[11]。KRAS突變、p53缺失可能是結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的潛在生物標(biāo)志物[12]。本研究結(jié)果表明，虎杖治療結(jié)直腸癌的靶點(diǎn)主要集中在ERS1，而KRAS亦為重要靶點(diǎn)之一，盡管目前EGFR抗體對(duì)RAS野生型結(jié)直腸癌顯示出較好的療效，但不能使KRAS突變型患者獲益[13]，故以虎杖為主藥的中藥制劑及復(fù)方可能在一定程度上提高KRAS突變患者的療效。

虎杖主要成分大黃酸可通過(guò)MAPK、PI3K/AKT、ERK等多條信號(hào)通路發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞活化、增殖、侵襲和遷移的作用[14]。本研究結(jié)果顯示，虎杖治療結(jié)直腸癌的相關(guān)靶點(diǎn)主要富集于調(diào)控生長(zhǎng)因子及其受體，包括EGFR信號(hào)通路、ERBB信號(hào)通路、PI3K/AKT信號(hào)通路、TP53信號(hào)通路。通過(guò)對(duì)活性成分的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，篩選出虎杖治療結(jié)直腸癌的主要靶點(diǎn)還有TYMS、AKT1、PPARD、PTGS1、FNTB、PTGS2、PPARG、ALDH2、PDE5A等基因，表明虎杖可通過(guò)多靶點(diǎn)、多通路發(fā)揮治療結(jié)直腸癌的作用。

本研究初步探討了虎杖治療結(jié)直腸癌的藥理機(jī)制，但虎杖活性成分較多，在腫瘤治療中發(fā)揮重要作用的許多成分如白藜蘆醇因OB、HL及DL未達(dá)到要求，未進(jìn)一步分析。因此，本研究結(jié)果仍需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

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（收稿日期：2018-07-28）

（修回日期：2018-08-16;編輯：向宇雁）