片仔癀對四氯化碳誘導肝纖維化大鼠肝功能及核因子-κB蛋白表達的影響

鄭海音 華麗萍 張玉琴 王曉穎 徐偉

摘要：目的? 觀察片仔癀對CCl4誘導的肝纖維化大鼠肝功能和核因子-κB（NF-κB）蛋白表達的影響，探討其作用機制。方法? 將24只大鼠隨機分為正常對照組、模型組、片仔癀組、秋水仙堿組，每組6只，50%CCl4灌胃8周制備肝纖維化模型。末次給藥1 h后，血清測定ALT、AST、Ⅲ型前膠原、Ⅳ型膠原、層黏連蛋白和透明質酸含量，取肝臟計算肝指數，HE染色和VG染色觀察肝組織病理形態，Western blot檢測NF-κB蛋白表達。結果? 與正常對照組比較，模型組大鼠肝指數及ALT、AST、Ⅲ型前膠原、Ⅳ型膠原、層黏連蛋白、透明質酸含量和NF-κB蛋白表達明顯升高（P<0.01）;與模型組比較，各給藥組大鼠肝指數及ALT、AST、Ⅲ型前膠原、Ⅳ型膠原、層黏連蛋白、透明質酸含量和NF-κB蛋白表達均明顯降低（P<0.01）。結論? 片仔癀對CCl4所致肝纖維化大鼠具有保護作用，其機制可能與抑制NF-κB的表達有關。

關鍵詞：片仔癀;肝纖維化;核因子-κB;大鼠

中圖分類號：R285.5? ? 文獻標識碼：A? ? 文章編號：1005-5304（2019）04-0057-04

維狀結構為特征，纖維疤痕破壞正常肝結構而影響肝功能最后導致肝衰竭[1-2]。肝纖維化的進展往往與肝硬化及肝癌有關[3-4]。肝纖維化雖可逆，但由于對病因及發病機制缺乏全面深入了解，至今臨床上未有上市的抗肝纖維化藥物[5]。近年來，中藥復方在干預肝纖維化方面作用顯著[6-7]。片仔癀由三七、麝香、牛黃、蛇膽等中藥組成[8]，有散瘀止血、消腫定痛的功效。有研究表明，片仔癀對肝纖維化和慢性肝損傷有一定的保護作用[9-11]。因此，本研究在上述基礎上，觀察片仔癀對CCl4誘導的肝纖維化大鼠肝功能和核因子-κB（NF-κB）蛋白表達的影響，探討其作用機制。

1? 實驗材料

1.1? 動物

SPF級雄性SD大鼠24只，體質量（250±20）g，福建中醫藥大學動物實驗中心，動物許可證號SCXK（滬）2017-0005。飼養于福建中醫藥大學動物實驗中心SPF級動物房，溫度21～23 ℃，相對濕度55%～75%，12 h晝夜循環。適應性飼養5 d后用于實驗。

1.2? 藥物

片仔癀，漳州片仔癀藥業公司，批號1703024;秋水仙堿片，西雙版納藥業有限公司，批號170306。

1.3? 主要試劑與儀器

CCl4，國藥集團化學試劑有限公司，批號20151109;花生油，魯花集團，批號20170325;水合氯醛，源葉生物科技有限公司，批號Z03D6Y7011;細胞裂解液、PMSF，碧云天生物技術有限公司，批號P00013B、ST506;ALT、AST試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號20180117、20180118;大鼠透明質酸（HA）、層黏連蛋白（LN）、Ⅲ型前膠原肽C端、Ⅳ型膠原ELISA試劑盒，上海西塘生物技術有限公司，批號分別為1803201、1804202、1803202、1804162。臺式冷凍離心機（美國貝克曼庫爾特公司），多功能酶標儀（奧地利Infinite公司），光學顯微鏡（德國LEICA公司），Mini-protean 3型垂直電泳槽（美國Bio-Rad公司），ChemiDoc XRS+凝膠成像分析系統（美國Bio-Rad公司）。

2? 實驗方法

2.1? 造模及給藥

根據文獻[12]及預實驗確定造模方法和給藥劑量。大鼠隨機分為正常對照組、模型組、片仔癀組、秋水仙堿組，每組6只。除正常對照組外，其余3組均給予CCl4花生油（1∶1）1 mL/kg灌胃，每周2次，共8周。造模同時，片仔癀組和秋水仙堿組予相應藥物灌胃。除正常對照組外，均予高脂飼料。片仔癀給藥量為0.15 g/100 g，秋水仙堿給藥量為0.1 mg/100 g。給藥體積0.5 mL/100 g，1次/d，連續8周。

2.2? 取材

實驗期間每周大鼠稱重2次。末次給藥前，禁食不禁水24 h。取材前，10%水合氯醛0.35 mL/100 g腹腔注射麻醉，腹主動脈取血。取血完成后，立即解剖取肝臟，用于HE染色和Western blot檢測。

2.3? 肝臟檢測

稱取肝臟質量，計算肝指數。肝指數（%）=肝臟濕重÷體質量×100%，隨后用相機對每組大鼠肝臟同一條件進行拍照，觀察肝臟形態。

2.4? HE染色

取同一部位0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm肝組織，4%多聚甲醛浸泡，固定24 h，石蠟切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫二甲苯，水洗，HE染色15 min，水洗，1%鹽酸乙醇鏡檢分化，乙醇脫水，中性樹膠封固。

2.5? VG染色

4%多聚甲醛固定肝組織，石蠟切片，常規脫蠟至水，95%乙醇稍洗，鹽酸乙醇分化，VG染色12 min，95%乙醇分化脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固鏡檢。

2.6? 血清指標檢測

將血離心獲得血清，用ALT、AST試劑盒和大鼠HA、LN、Ⅲ型前膠原肽C端免疫檢測試劑盒、Ⅳ型膠原ELISA定量檢測試劑盒進行測定。

2.7? Western blot檢測

取肝組織，4 ℃冰浴，以1∶10比例（0.1 g肝組織∶1 mL裂解液）加入裂解液徹底研磨，12 000 r/min，離心5 min，取上清液，用BCA試劑盒進行蛋白含量的測定，按一定比例加入5×loading Dye，100 ℃變性10 min后，上樣，電泳，PVDF轉膜，5%脫脂奶粉封閉 2 h，TBST清洗3次×10 min，孵育一抗（NF-κB 1∶1000），4 ℃搖床過夜。第2日，TBST清洗3次×10 min，孵育二抗（1∶5000）2 h，TBST清洗，顯影。以GAPDH為內參，用Image Lab計算光密度值。

3? 統計學方法

采用SPSS21.0統計軟件進行分析。實驗數據以x（—）±s表示，組間比較用方差分析。P<0.05表示差異有統計學意義。

4? 結果

4.1? 片仔癀對肝纖維化大鼠體質量的影響

在實驗8周內，正常對照組大鼠體質量勻速增長，精神狀態良好;模型組第1次造模后均出現較大幅度體質量持續降低，且精神低迷，活動力下降，持續約2周，第3周起，各組體質量持平并開始增加，但增幅與正常對照組相比較遲緩，活動力得到一定好轉但明顯遲緩于正常對照組;各給藥組大鼠精神狀態及毛發亮澤均有一定程度的好轉。見表1。

4.2? 片仔癀對模型大鼠肝臟形態的影響

正常對照組大鼠肝臟顏色紅潤，表面光滑，質地柔軟;模型組大鼠肝臟明顯腫大，呈黃褐色，表面粗糙呈顆粒狀;片仔癀組和秋水仙堿組大鼠較模型組肝臟腫大均有一定程度的降低，表面光滑及顏色有一定好轉，更接近正常對照組大鼠肝臟形態。見圖1。

4.3? 片仔癀對模型大鼠肝指數的影響

與正常對照組比較，模型組大鼠肝指數顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，片仔癀組和秋水仙堿組大鼠肝指數均顯著降低（P<0.01）。見圖2。

4.4? 片仔癀對模型大鼠肝組織病理形態的影響

HE染色結果顯示，正常對照組大鼠肝組織形態正常;模型組大鼠肝細胞大量脂肪變性，炎性細胞浸潤，大量纖維結締組織增生，正常肝小葉結構被破壞，甚至出現肝小葉結構重新構建;片仔癀組和秋水仙堿組大鼠肝細胞脂肪變性明顯減少，炎性細胞水平顯著降低，纖維增生程度明顯減輕，但未恢復至空白對照組的正常水平。VG染色結果顯示，膠原纖維深粉色，與正常對照組比較，模型組大鼠膠原纖維明顯增多，肝小葉結構受到破壞，各給藥組大鼠肝纖維化呈現一定程度的好轉。見圖3。

4.5? 片仔癀對模型大鼠血清相關因子的影響

與正常對照組比較，模型組大鼠血清ALT、AST、Ⅳ型膠原、Ⅲ型前膠原、HA和LN均顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，片仔癀組和秋水仙堿組大鼠血清ALT、AST、Ⅳ膠原、Ⅲ型前膠原、HA和LN均顯著降低（P<0.01）。見圖4～圖6。

4.6? 片仔癀對模型大鼠核因子-κB蛋白表達的影響

與正常對照組比較，模型組大鼠肝組織NF-κB蛋白表達明顯升高（P<0.01）;與模型組比較，片仔癀組和秋水仙堿組大鼠肝組織NF-κB蛋白表達明顯降低（P<0.01）。見圖7。

5? 討論

肝纖維化是多種原因引起的慢性肝損害所致的病理改變，表現為肝內ECM過度異常地沉積，并影響肝臟的功能。肝纖維化最終會導致終末期肝硬化和肝細胞癌，同時嚴重影響患者的生活質量。CCl4誘導的肝纖維化模型是現階段最為常見的肝纖維化模型。本實驗以CCl4構建肝纖維化大鼠模型為基礎，進行其作用及機制研究。結果表明，模型組大鼠肝臟出現不同程度腫大，血清ALT、AST、HA、LN、Ⅲ型前膠原、Ⅳ型膠原等指標明顯升高，表明模型大鼠肝功能遭到嚴重的損傷以及纖維化，而給予片仔癀治療后，這些指標明顯改善，說明片仔癀對肝纖維化有較好的保護作用。

NF-κB是一種多功能的核轉錄因子，幾乎存在于所有細胞中，它調控多種細胞因子的表達，從而調節多種生理病理過程，如炎癥、細胞凋亡等，在肝臟炎癥、肝纖維化及肝細胞再生中都擔任重要的角色。它以同構或異構二聚體形式存在，其中p65和p50是普遍存在的異源二聚體，控制著大多數NF-κB上調基因的表達。近年來大量實驗表明，NF-κB參與肝纖維化的增殖與凋亡，它上調腫瘤壞死因子-α，誘導肝星狀細胞的活化，從而引起肝纖維化[9-10]。本實驗結果顯示，模型組大鼠NF-κB表達量顯著升高，片仔癀干預可顯著降低大鼠肝組織NF-κB的蛋白表達。

綜上，片仔癀可明顯降低肝纖維化大鼠肝臟NF-κB的表達，起到抗肝纖維化的作用。目前臨床上尚缺乏確實有效的藥物，特異性抗肝纖維化的藥物研發還處于初始階段，加快中藥抗肝纖維化的研究進程十分必要。

參考文獻：

[1] SUN M， KISSELEVA T. Reversibility of liver fibrosis[J]. Clin Res Hepatol Gastroenterol，2016，39（Suppl1）：S60-63.

[2] LEE Y A， WALLACE M C， FRIEDMAN S L. Pathobiology of liver fibrosis：a translational success story[J]. Cut，2015，64（5）：830- 841.

[3] YANG J J， TAO H， LI J. Hedgehog signaling pathway as key player in liver fibrosis：new insights and perspectives[J]. Expert Opin Ther Targets，2014，18（9）：1011-1021.

[4] 王晨曉，羅偉生，郭瀟，等.絡化纖丸聯合核苷（酸）類藥物治療慢性乙型肝炎肝纖維化的系統評價[J].中國實驗方劑學雜志，2015，21（7）：203-209.

[5] CHENG Q， LI N， CHEN M， et al. Fuzheng Huayu inhibits carbon tetrachloride-induced liver fibrosis in mice through activating hepatic NK cells[J]. J Ethnophamacol，2013，145（1）：175-181.

[6] 葉靜，劉清華，王璐璐.抗肝纖維化藥物治療的研究進展[J].山東醫藥，2014，54（42）：101-103.

[7] 曾璐，周本杰.肝纖維化發病機制和治療方法的研究進展[J].廣東醫藥，2014，35（24）：3918-3921.

[8] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[M].北京：中國醫藥科技出版社，2015：670.

[9] 李倩.白藜蘆醇介導NF-κB轉錄及PI3K磷酸化抑制肝星狀細胞活化的分子機制研究[D].延邊：延邊大學，2013.

[10] 吳楠.NF-κB在胰腺星狀細胞活化中的作用及黃芩苷對其干預機制研究[D].咸陽：陜西中醫藥大學，2017.

[11] 洪緋，趙錦燕，張澤修，等.復方片仔癀肝保片對大鼠四氯化碳誘導的慢性肝損傷的治療作用[J].福建中醫藥，2014，45（5）：53-54，60.

[12] 率紅莉，方步武，邢偉，等.蒿鱉養陰軟堅方對四氯化碳復合因素所致肝纖維化的預防作用[J].中國實驗方劑學雜志，2013，19（16）：197-201.

（收稿日期：2018-08-10）

（修回日期：2018-09-12;編輯：華強）