超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)分析人體血漿中硫酸吲哚酚及硫酸對(duì)甲酚含量

肖永華*， 革麗亞， 朱 慶， 毛 翔， 萬嚴(yán)建， 黃常剛

(武漢市疾病預(yù)防控制中心，湖北武漢 430022)

硫酸吲哚酚(IS)和硫酸對(duì)甲酚(p-CS)分別為絡(luò)氨酸和色氨酸在腸道細(xì)菌作用下的代謝產(chǎn)物，腸道厭氧菌將食物中的酪氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)?-羥基苯乙酸，4-羥基苯乙酸脫羧為對(duì)甲酚，大部分對(duì)甲酚經(jīng)腸道黏膜吸收，在腸道上皮細(xì)胞磺基轉(zhuǎn)移酶的作用下轉(zhuǎn)化為p-CS；食物中的色氨酸經(jīng)大腸埃希菌分解產(chǎn)生吲哚，吲哚經(jīng)門靜脈進(jìn)入肝臟經(jīng)羥化、硫酸化，最終生成IS[1 - 2]。當(dāng)人體腎功能出現(xiàn)障礙時(shí)，p-CS和IS不能被有效的排除體外，從而導(dǎo)致在體內(nèi)蓄積。有研究表明，p-CS和IS具有腎臟毒性和心血管毒性，能促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡，加重動(dòng)脈鈣化使動(dòng)脈壁變厚以及心室肥大[3 - 6]；p-CS和IS還能促進(jìn)腎間質(zhì)細(xì)胞向成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，引起腎臟的纖維化，屬尿毒癥毒素[7 - 9]。目前，我國(guó)慢性腎病的發(fā)病率高達(dá)11%，發(fā)病率和血液透析人數(shù)呈逐年上升趨勢(shì)[10]。在慢性腎病患者的隊(duì)列研究中，游離p-CS被發(fā)現(xiàn)是慢性腎病患者的一個(gè)重要的死亡率預(yù)測(cè)因子[11]。因而監(jiān)測(cè)血液透析患者中p-CS和IS含量具有十分重要的臨床意義。

檢測(cè)p-CS和IS的方法主要有高效液相色譜-熒光法[12 - 13]以及高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[14]。相比于前者，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法靈敏度更高，定性更準(zhǔn)確。本文采用乙腈沉淀血清白蛋白，離心后將上清液用超純水稀釋，建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)腎病血液透析患者血漿中p-CS和IS含量。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

UPLC-TQD超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)，Waters公司)，配備電噴霧離子源(ESI)以及Masslynx4.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；AL204電子天平(瑞士，Mettler Toledo公司)；IKA渦旋振蕩器(德國(guó)，IKA公司)；TGL-16B高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

硫酸吲哚酚(IS)、硫酸吲哚酚-d4(IS-d4)購(gòu)自Sigma公司，硫酸對(duì)甲酚(p-CS)、硫酸對(duì)甲酚-d7(p-CS-d7)購(gòu)自Toronto公司。IS和p-CS分別用乙腈配制成100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，IS-d4、p-CS-d7分別用乙腈配制成1.0 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-18 ℃避光保存。乙腈、甲醇(色譜純，美國(guó)天地公司)，乙酸銨(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q純水機(jī)(德國(guó)默克密理博公司)制備。

1.2 樣品處理

選擇某醫(yī)院血液透析中心23名血液透析患者作為監(jiān)測(cè)對(duì)象(監(jiān)測(cè)對(duì)象均簽署知情同意書)，分別于血液透析前和血液透析后，抽取監(jiān)測(cè)對(duì)象的血液于不加抗凝劑的采血管中，高速離心后將上層血漿取出于-18 ℃ 保存，分析前將血漿取出恢復(fù)至室溫后，吸取100 μL血漿于1.5 mL EP離心管中，加入200 μL 1.0 μg/mL內(nèi)標(biāo)和700 μL乙腈，渦旋1 min后，用高速離心機(jī)以10 000 r/min離心5 min，再吸取100 μL上清液，加入900 μL超純水，渦旋混勻后測(cè)定。

1.3 儀器條件

色譜條件：Waters UPLC?HSS T3色譜柱(100×2.1 mm，1.8 μm；美國(guó)Waters公司)；流動(dòng)相A為5 mmol/L 乙酸銨溶液，B為甲醇；梯度洗脫程序：0～1.5 min，95%A；1.5～3.0 min,95%～5%A；3.0～4.5 min,5%A；4.5～5.0 min,5%～95%A。流速：0.2 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI)，負(fù)離子模式；毛細(xì)管電壓：-2.3 kV；脫溶劑氣溫度：350 ℃；離子源溫度：120 ℃；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)。通過質(zhì)譜直接進(jìn)樣的方式優(yōu)化IS和p-CS質(zhì)譜參數(shù)，MRM采集參數(shù)詳見表1。

表1 p -CS和IS的MRM參數(shù)

*:quantitative ion.

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品提取條件優(yōu)化

p-CS和IS在人體內(nèi)與血清白蛋白的結(jié)合率達(dá)到了90%以上，均結(jié)合在血清白蛋白Ⅱ區(qū)，通過靜電作用力與血清白蛋白非共價(jià)結(jié)合[15 - 16]。當(dāng)血清被加熱、稀釋、加入強(qiáng)電解質(zhì)溶液或加入有機(jī)相使血清白蛋白產(chǎn)生沉淀時(shí)，p-CS和IS與血清白蛋白的非共價(jià)結(jié)合被破壞，p-CS和IS由結(jié)合態(tài)轉(zhuǎn)化為游離態(tài)[17]。在純乙腈介質(zhì)中p-CS和IS的色譜峰較寬且有分叉現(xiàn)象，隨著介質(zhì)中水相比例的增加色譜峰峰寬逐漸變窄，本文選取先用乙腈沉淀血清蛋白，離心后上清液用水稀釋10倍后檢測(cè)，即樣品溶劑為水∶乙腈(9∶1，V/V)。

2.2 流動(dòng)相的選擇

以甲醇-水作為流動(dòng)相時(shí)，p-CS和IS色譜峰有重疊現(xiàn)象，不能很好的分離，將水更換為5mmol/L乙酸銨溶液時(shí)，p-CS和IS分離度有所改善，達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求，因而本文選取甲醇-5mmol/L乙酸銨溶液作為分析p-CS和IS的流動(dòng)相，p-CS、p-CS-d7、IS和IS-d4的MRM色譜圖見圖1。

圖1 p -CS、p -CS-d7、IS和IS-d4的MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of p -CS,p -CS-d7,IS and IS-d4

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1線性關(guān)系及檢出限將100 μg/mLp-CS和IS混合標(biāo)準(zhǔn)溶液用水稀釋，配制濃度分別為5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/Lp-CS和IS混合標(biāo)準(zhǔn)系列，內(nèi)標(biāo)p-CS-d7和IS-d4的濃度均為20 μg/L，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，p-CS回歸方程為：Y=26.83X+19.66，相關(guān)系數(shù)r=0.9993;IS回歸方程為：Y=7.74X+5.72，相關(guān)系數(shù)r=0.9997。以3倍信噪比計(jì)算方法的檢出限，IS和p-CS的儀器檢出限分別為0.5 μg/L和0.1 μg/L。

2.3.2回收率和精密度準(zhǔn)確吸取100 μL血漿樣品，分別加入1.0、5.0、10 μg/mLp-CS和IS混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.2方法處理樣品，計(jì)算加標(biāo)回收率，分析結(jié)果見表2。

2.4 樣品分析

在上述實(shí)驗(yàn)條件下，分析了23位監(jiān)測(cè)對(duì)象血液透析前和血液透析后的血漿中p-CS和IS的濃度水平，p-CS結(jié)果見圖2，IS結(jié)果見圖3。

表2 血漿中p -CS和IS加標(biāo)回收率及精密度(n=6)

圖2 23位血液透析患者p -CS含量Fig.2 Content of p -CS in 23 hemodialysis patients

圖3 23位血液透析患者IS含量Fig.3 Content of IS in 23 hemodialysis patients

血液透析患者透析前p-CS和IS濃度分別為1.47～204.69 μg/mL、5.31～62.97 μg/mL，透析后p-CS 和IS濃度分別為1.41～107.91 μg/mL、2.04～48.3 μg/mL。通過透析血漿中p-CS和IS濃度均有所降低，其中p-CS降低了4.08%～58.5%，IS降低了5.39%～63.0%。從圖2、圖3可以看出，高濃度的p-CS和IS通過血液透析后降低的比例并不比低濃度p-CS和IS降低的比例高，通過血液透析降低的比例跟p-CS和IS的濃度不呈線性相關(guān)。同時(shí)通過自身配對(duì)t檢驗(yàn)對(duì)血液透析前后p-CS和IS的濃度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果均顯示P<0.01，說明血液透析前后p-CS和IS的濃度有顯著性差異。由此可見，通過血液透析可有效降低血液透析患者血漿中p-CS和IS濃度。

3 結(jié)論

該方法簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高，適用于監(jiān)測(cè)人體血漿中p-CS及IS濃度水平。下一步將結(jié)合病程、透析方式等因素，更進(jìn)一步研究p-CS和IS與慢性腎病的相互關(guān)系，為慢性腎病患者的治療方案提供更加充分、科學(xué)、可行的依據(jù)。