香豆素基甲醛熒光探針的合成及其性能研究

李和平， 陳忠曉， 秦鑫鑫， 江 升， 趙 超, 肖 青

(1.道路結構與材料交通行業重點實驗室，長沙理工大學化學與生物工程學院,湖南長沙 410114; 2.云南水利水電職業學院基礎教育部,云南昆明 650499)

甲醛(FA)是一種重要的工業原料,它廣泛應用于制造業、食品防腐和藥物合成等領域,因其與DNA和蛋白質具有非常強大的結合力,長期暴露于甲醛環境中會導致記憶力衰退和各種神經性疾病[1]。但現代研究發現,在組蛋白去甲基化或DNA甲基化過程中，以及甲胺和多胺的降解過程中，生物系統中可能產生內源性甲醛[2]，但它在體內發揮何種生理功能尚不可知，因此，開發可檢測甲醛的有效成像劑有利于研究內源性甲醛的生理功能。目前檢測甲醛的主要方法有比色法、電化學法、熒光分光光度法、高效液相色譜法和紅外光譜法[3]。相比其他幾種方法,熒光分光光度法具有靈敏度高、操作方便、重現性好、實時檢測等特點,但是由于現在所用到的成像劑大多含有萘環[4 - 5]、二酮類[6]對人體有毒化合物,因此開發生物系統背景下檢測甲醛的優秀分子工具,在臨床診斷方面具有重要意義。

香豆素廣泛存在于蕓香科、豆科、茄科等天然植物和微生物代謝產物中,在熒光分析、染料、生物醫藥等領域都有著極其廣泛的應用[7]，而且作為一種天然產物，不僅對人體無毒，且具有抗病毒、抗癌等生理功能,特別是在抗HIV活性、抑制癌細胞生長和誘導凋亡方面表現出優秀的藥理特性[8]，以香豆素類衍生物為熒光團的熒光探針具有熒光量子產率高,Stokes位移大,光穩定性高等優點[9 - 10]。因此，最近幾年香豆素類衍生物應用于有機熒光染料的研究得到了廣泛的重視。

本文基于光誘導電子轉移(PET)機理,將肼與4-甲基-7-羥基-8-甲?；愣顾叵嘟Y合,引入甲腙基作為熒光猝滅基團和甲醛識別基團,得到了一種檢測甲醛的新型熒光探針4-甲基-7-羥基-8-甲酰基香豆素(CNH)，為研究內源性甲醛的生理功能提供有效的分子工具。

1 實驗部分

1.1 儀器及試劑

Aglient 1100 series 液相色譜/質譜儀(美國，安捷倫公司);Varian Mecury(300 MHz)核磁共振儀(美國，VARIAN公司);JY02S型紫外分析儀(北京君意東方電泳設備有限公司);MCR-3型微波化學反應器(上海標和儀器有限公司);Avatar-360紅外光譜儀(美國，Nicolet);U-4100紫外光譜儀(日本，日立公司);SGWX-4顯微熔點測定儀(上海精密科學儀器有限公司);F-7000熒光光譜儀(日本，日立公司)。

實驗所用試劑均為市售分析純或化學純，無需進一步處理。實驗用水為去離子水。

1.2 實驗方法

1.2.14-甲基-7-羥基香豆素(MC)的合成參考文獻方法[11]合成并有所改進,主要改進的是采用H3PO4(85%)作為催化劑。

1.2.24-甲基-7-羥基-8-甲?；愣顾?MFC)的合成取4-甲基-7-羥基香豆素10.2470 g(0.058 mol),六亞甲基四氨(HMTA)19.8292 g(0.142 mol),置于500 mL的圓底燒瓶中.加入100 mL的冰HAc,溫度90 ℃下水浴回流5 h后,微波10 min(90 ℃);自然冷卻至室溫后加入150 mL 20%HCl,70 ℃下繼續水浴回流1 h,再微波10 min(70 ℃);自然冷卻后倒入500 mL冰水混合物中充分攪拌1 h,析出大量的黃色固體;用200 mL×1,100 mL×2的乙酸乙酯萃取，合并萃取液后,無水Na2SO4干燥;旋轉蒸發至剩余少量液體后,過濾(相當于進行一次重結晶),真空干燥得淡黃色產物1.5163 g,產率12.80%。

m.p.:179～181 ℃;IR(KBr):3 428.86 cm-1(-OH),1 723.63 cm-1(-CO),1 607.69 cm-1(-CHO),1 594 cm-1(-C=C);1H NMR(300 MHz,DMSO-d6):δ:2.43(s,3H,C4-CH3),6.32(s,1H,C3-H),6.93(d,1H,C6-H,J=8.9 Hz),7.93～7.97(d,1H,C5-H,J=8.9 Hz),10.46(s,1H,CHO),11.90(s,1H,OH);MS:m/z204.1(M+),分子式C11H8O4,計算值204.0。

1.2.3探針CNH的合成在50 mL的圓底燒瓶中,加入MFC 0.8932 g(4.38 mmol),20 mL的乙醇,5 mL 的水合肼,于70 ℃下水浴回流4.5 h,旋轉蒸發至剩余少量溶液,過濾,水洗2次,乙醇洗一次,真空干燥得泛黃白色固體0.8020 g,產率為83.97%。

1H NMR(300 MHz,DMSO-d6):δ:2.40(s,3H,C4-CH3),6.21(s,1H,C3-H),6.86～6.88(d,1H,C6-H,J=8.9 Hz),7.36(s,2H,-NH2),7.56(d,1H,C5-H,J=8.9 Hz),8.42(s,1H,-CH=N-),12.79(s,1H,OH);MS：m/z218.1(M+),分子式C11H10N2O3,計算值218.1。

1.2.4CNH-甲醛的合成在50 mL的圓底燒瓶中,加入探針CNH 0.3027 g(1.316 mmol),2 mL甲醛(≥37%),18 mL去離子水，室溫下攪拌10 min,過濾,水洗,真空干燥,得泛黃白色固體0.2510 g,產率為76.80%。

MS：m/z230.1(M+),分子式C12H10N2O3,計算值230.1。

1.3 溶液的配制

室溫下,將探針CNH和化合物CNH-甲醛，分別溶解于二甲基亞砜(DMSO)中,加入磷酸鹽緩沖溶液(PBS)，配制成1 mmol/L的儲備液(pH=7.4)。實驗所用到的甲醛、氨基酸等其它分析物均先溶于DMSO,再加入PBS，配制成1 mmol/L的儲備溶液(pH=7.4)。實驗時所需不同濃度的溶液均以PBS(pH=7.4)稀釋得到。

1.4 熒光光譜測定

1.4.1探針對甲醛的響應性在10 mL 30 μmol/L CNH的PBS(pH=7.4)中,加入0～200 μmol/L的甲醛溶液,在相同的實驗條件下,振蕩后靜置1 min,測定熒光光譜。

1.4.2探針對甲醛的響應時間在相同的實驗條件下,測定30 μmol/L CNH的PBS(pH=7.4)的熒光光譜,然后立即加入等物質的量的甲醛溶液,持續掃描10 min,測量時間響應曲線。

1.4.3探針的選擇性取不同的分析物各1 mmol/L,加入30 μmol/L CNH的PBS(pH=7.4),靜置1 0 min后,在相同的實驗條件下測量熒光光譜,隨后在三色紫外燈下進行比色測定。

2 結果與討論

2.1 探針CNH的設計與合成

基于光誘導電子轉移(PET)[4]機理,設計合成了新型熒光探針CNH。探針CNH的合成路線如圖1所示。

圖1 CNH合成路線及其檢測甲醛的機理Fig.1 Synthesis of probe CNH and the mechanism of the “off-on” detection for formaldehyde(FA)

很多文獻對4-甲基-7-羥基香豆素的合成早已有報道,常用的方法有Perkin反應和Pechmann反應[11]。本文采用簡單易行的Pechmann合成法構建4-甲基-7-羥基香豆素熒光團,實驗以H3PO4(85%)為反應催化劑,避免了強酸的加入,利用廉價易得的間苯二酚與乙酰乙酸乙酯，在室溫條件下反應得到MC,繼而采用Duff反應[12]將其8號位甲?；?整個實驗原料易得，條件溫和,副反應少,均采取重結晶的方式提純目標產物,省去了硅膠色譜柱純化,操作簡單。探針CNH對甲醛的識別機理是在由于探針CNH的-NH2的給電子作用，光誘導電子轉移受阻,熒光猝滅，與甲醛作用后生成-N=CH2而熒光恢復[4]。

2.2 甲醛濃度對探針CNH熒光強度的影響

圖2 甲醛濃度(0～400 μmol/L)對CNH(5 μmol/L)熒光強度的影響Fig.2 Effect of FA concentrations on the probe CNH(5 μmol/L) fluorescence intensities in PBS buffer 25 ℃，pH=7.4,1%DMSO，λex=325 nm.

基于本研究是以檢測內源性甲醛為目標，因此選定血液(pH=7.4)和室溫作為研究的固定條件，下述研究都在此基礎上進行。為了測定探針CNH對甲醛的敏感性,向探針CNH溶液中加入不同濃度甲醛，立即測定其熒光光譜,如圖2所示。由圖2可知，隨著甲醛濃度的升高(0～400 μmol/L),探針CNH溶液的熒光強度不斷增大,當甲醛濃度達到100 μmol/L,探針溶液的熒光強度幾乎不變。取甲醛濃度0～100 μmol/L，λem=450 nm的熒光強度數據進行作圖，并線性擬合,得到(Imin-I)/(Imin-Imax)對甲醛濃度的對數lgc的線性回歸曲線方程為:y=0.9523x+4.7652，相關系數R2=0.9876,由此計算得探針CNH對甲醛的檢測限為1.0×10-5mol/L。

2.3 探針CNH對甲醛的響應時間研究

為了測定探針CNH對FA的響應時間，將等物質的量的探針CNH與甲醛溶液混合，測定不同時間后的熒光強度,如圖3所示。由圖3可知，探針CNH與甲醛的反應在室溫下約400 s即可完成，說明探針CNH對甲醛具有反應快速的優點。

2.4 探針CNH對甲醛的選擇性研究

探針的專一性選擇是評價其性能的重要因素。為了研究探針對甲醛的選擇特異性,采用熒光光譜測定探針CNH對其它分析物的響應性，如圖4所示。由圖4可知，探針CNH與甲醛溶液混合后,顯示出了更強的熒光信號,表明探針對甲醛具有高度的特異性。用三色紫外燈(波長365 nm)照射探針CNH與甲醛等不同分析物混合后的溶液，發現探針CNH與甲醛的混合溶液發微弱的光,而探針CNH與CuSO4、丙酮等其它物質混合后的溶液發出亮光，探針CNH對甲醛在紫外燈下具有獨特的顏色顯示，通過裸眼即可快速比色檢測，為實現對環境中甲醛的實時監測提供便利。

圖3 CNH(5 μmol/L)熒光強度在有(A)和無(B)甲醛(5 μmol/L)時隨時間變化曲線Fig.3 Reaction-time profiles of the probe CNH(5 μmol/L) in the presence(A) and absence(B) of FA(5 μmol/L) in PBS buffer 25 ℃，pH=7.4,1%DMSO，λex/λem=325/450 nm.

圖4 探針CNH(10 μmol/L)在各種分析物存在時的熒光強度Fig.4 Fluorescence intensity of probe CNH(10 μmol/L) in the presence of various analyte in 20 mmol/L PBS buffer(pH=7.4) 1%DMSO,λex/λem=325/450 nm.1:free CNH;2:H2O2;3:CuSO4;4:CaCl2;5:FA;6:CH3CHO;7:C6H5CHO;8:glycine;9:acetone.

3 結論

以香豆素衍生物為熒光團,構建合成了一種新型的檢測甲醛的熒光探針(CNH)。該熒光探針CNH對甲醛具有高的選擇性和靈敏度、低檢測限和響應快等優點,而且與現有的檢測甲醛的探針相比，探針CNH以天然香豆素結構為母核，本身無毒性，可作為研究內源性甲醛的生理功能的熒光探針。而且，在紫外光照射下,通過比色可實現裸眼識別，為環境部門快速有效監測甲醛提供了有效的分子工具,在甲醛檢測領域具有廣闊的應用前景。