基于2,4-二硝基氟苯標記氨基酸的高效液相色譜法測定脂肽含量

邵穿石， 楊世忠， 郎劍橋， 楊佳穎， 牟伯中*

(生物反應器工程國家重點實驗室及應用化學研究所，華東理工大學，上海 200237)

脂肽是一類重要的生物表面活性劑，如表面活性素、地衣素、伊枯草菌素、豐原素等，通常由微生物產生[1]。據報道，脂肽主要是環狀脂肽，根據脂肪酸與肽間的關系可以分為3類[2]，有約90種不同的脂肽[3]。某些脂肽具有抗癌、抑菌、抗凝血作用[4 - 6]，促進烴降解[7]及可與金屬離子螯合作用[8]。由于脂肽的兩親結構及其表現出的很強表面活性和生物活性，脂肽在許多方面有潛在的用途，如食品、化妝品、藥物、環保及采油等領域。

脂肽和許多有活性物質一樣，對產生菌及應用的研究和評價離不開定量測定，對脂肽的測定方法較方便的是直接高效液相色譜(HPLC)法[9]，樣品經簡單處理，直接進樣測定。根據大部分脂肽中氨基酸與茚三酮在特定條件下反應產生的可見吸收，其摩爾吸收系數相近的特性[10]，用光度法也可以測定脂肽[11]。為了測定脂肽中的不同變體，可將脂肽水解后用氣相色譜-質譜(GC)法測定[12]。該方法不僅能對脂肽進行定量，還可以定量脂肽中脂肪酸碳數不同的異構體，但反應需要無水狀態。本文將提取的一種脂肽(表面活性素)先水解成其組成的氨基酸，然后以2,4-二硝基氟苯標記產生的氨基酸后，采用HPLC法測定標記的目標氨基酸。根據脂肽中氨基酸與標記產物色譜峰面積的線性關系，建立了一種測定脂肽含量的新方法。

1 實驗部分

1.1 主要試劑及儀器

亮氨酸、纈氨酸、天門冬氨酸(分析純，上海捷倍思基因技術有限公司)，谷氨酸(生化試劑，上海化學試劑公司)，2，4-二硝基氟苯(FDNB)(生化試劑，上海金山興塔化工廠)，NaOH、HCl、三乙胺、乙腈(分析純，上海凌峰化學試劑有限公司)，實驗用水為純水。

質譜儀(Micromass LCT,Manchester,UK)；高效液相色譜儀(LC100 plus,上海伍豐科學儀器有限公司，上海)。

1.2 實驗方法

1.2.1脂肽的提取取500 mL脂肽發酵液，調節pH>9， 5 000 r/min離心除菌，取上清液，滴加HCl酸化，使pH ≤ 2.0，室溫下靜置24 h， 5 000 r/min下離心30 min，收集沉淀，在4 ℃下冷凍干燥24 h，得到淡黃色塊狀固體，用40 mL乙酸乙酯浸提3次，用20 mL水洗滌3次，濃縮并用乙酸乙酯定容至20.0 mL。

1.2.2脂肽的定性取10 mL脂肽發酵液，2 000 r/min離心除菌，在上清液中滴加HCl酸化，使pH≤2.0，用2.0 mL、1.0 mL及1.0 mL乙醚萃取3次。合并乙醚后，用2.0 mL水洗滌3次，吹除乙醚。加入1.0 mL甲醇溶解殘留物，用電噴霧質譜(ESI-MS)分析，測定分子量，確定脂肽類型。質譜采用正離子模式，噴射電壓為4.8 kV；毛細管電壓設置為15 V，以N2為鞘氣，流速為50 μL/min；輔助器流速設置為20 μL/min；以He為碰撞氣；測定質譜，分析常見脂肽m/z850～1 250 Da范圍的質譜圖。

1.2.3脂肽水解取一定量的脂肽有機溶液于2.00 mL刻度凍存管中，吹除有機溶劑后，加入1.00 mL 6.0 mol/L NaOH溶液，密封，90 ℃溫度下水解24 h[13]，或在除去有機溶劑后的脂肽樣品中加入標準氨基酸溶液，干燥后，同樣用NaOH水溶液水解。水解后的溶液，加入0.50 mL濃HCl，隨后用1.0 mol/L稀HCl和稀NaOH溶液調節到中性(用點樣毛細管取樣檢測)，用水定容到2.00 mL備用，其中的NaCl濃度為3.0 mol/L。

1.2.4標記反應在試管中加入含3.00 mol/L NaCl的標準氨基酸(2.00 mmol/L Asp、Glu、Val及8.00 mmol/L，相當于2.00 mmol/L脂肽表面活性素中的氨基酸)溶液，補加3.00 mol/L NaCl溶液至0.800 mL，分別加入0.200 mL的三乙胺及1.000 mL 1.0% FDNB-乙腈溶液，充分混勻后，置于75 ℃水浴中加熱，反應30 min，冷卻，用0.22 μm有機微孔濾膜過濾，濾液用HPLC法測定。

1.2.5液相色譜測定用HPLC儀配備Arcus自動進樣器測定，梯度洗脫：0～2 min，2%乙腈水溶液；22 min，25%乙腈水溶液。紫外360 nm波長檢測，進樣10.0 μL。

2 結果討論

脂肽水解后疏水部分產生羥基脂肪酸或氨基脂肪酸，親水部分產生氨基酸。氨基酸酸中通常有一分子谷氨酸/酰胺和天門冬氨酸/酰胺，有多個亮氨酸(Leu)，如表面活性素，一分子脂肽中有谷氨酸(Glu)、天門冬氨酸(Asp)、纈氨酸(Val)各一分子，有四分子的Leu酸[10,14]。如果脂肽以Leu的形式測定，靈敏度較以其它氨基酸形式測定的靈敏度要高。擬以測定Leu的方式測定脂肽的含量。

氨基酸的測定在化學及生物化學的研究中有重要意義，具體有氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、毛細管電泳法(CE)等。氨基酸本身不易檢測，需要用熒光標記試劑或紫外標記試劑標記后檢測。硝基氟苯標記氨基酸的產物性質穩定，本文選用硝基氟苯標記氨基酸[15]，用HPLC法分離測定Leu的方法來定量脂肽。

2.1 脂肽的類型

圖1 脂肽樣品的質譜圖Fig.1 The mass spectrum of lipopeptide in sample

圖2 脂肽surfactin的結構示意圖Fig.2 The primary structure of lipopeptide surfactin

用電噴霧質譜測定了脂肽正離子化的質荷比，結果見圖1。從正離子化質譜圖中可見m/z1 008.8、1 022.8、1 036.8 及1 050.7(1 044.8與1 058.8之間)的離子，它們彼此相差14(CH2)的質量，可以認為是同系物。與此相似，m/z1 030.8(1022.8與1 036.8之間)、1 044.8、1 058.8 及1 072.8，也相差14，也為同系物。這兩組同系物的質荷比之間相差22。因脂肽的肽部分是強極性的、有電負性大的基團，可以結合H+、Na+等離子后，形成帶正電的[M+1]、[M+23]分子離子，它們的質荷比相差22。顯然，上述兩組質荷比為一同系物的H+離子化和Na+離子化產生的。故其分子量為m/z-1或m/z-23，從而得到分析的脂肽的分子量分別為1 007.8、1 021.8、1 035.8和1 049.8。根據脂肽的結構[2]指紋圖譜[3]，這些分子與一種重要的脂肽表面活性素的分子量一致，確定該脂肽為表面活性素系列化合物[16]。它們的Leu相同，含有1個Asp、Glu和Val殘基及4個Leu殘基，水解后產生相應的氨基酸，其結構示意圖如圖2。脂肽中的羥基脂肪可有C12、C13、C14、C15和C16，其中以C13、C14和C15為主。根據其脂肪酸的比例代表脂肽的比例[12]和相應的分子量，可以計算出脂肽的平均分子量約為1 028 Da。

2.2 色譜上氨基酸的識別

圖3 樣品標記產物的色譜圖Fig.3 Chromatogram of labeled derivetives

含氨基酸Val和Leu的樣品、脂肽水解后的樣品及脂肽中加入氨基酸Val和Leu水解后的樣品，經標記反應，冷卻、過濾，HPLC法測定的結果如圖3所示。用單一氨基酸標記測定，確定保留時間17.82～18.07 min是標記的Val，保留時間21.10～21.27 min是標記的Leu，Glu及Asp兩種氨基酸標記產物在采用的色譜條件下與標記試劑不能分離。氨基酸樣品除標記試劑的色譜峰(5～13 min，未畫出)外，在保留時間17.82～18.07 min和21.10～21.27 min有兩個色譜峰，且面積之比約為1∶4，與配制的比例一致；脂肽經水解釋放出其中的氨基酸，標記后的產物在相應保留時間處也出現色譜峰，峰面積的比例也約為1∶4；脂肽加入氨基酸后水解、標記，測定結果也顯示，保留時間不變，與脂肽相比峰面積增加，面積比仍然為1∶4。

2.3 氨基酸量與標記產物峰面積的定量關系

按脂肽中氨基酸的組成，配制含3.00 mol/L NaCl的14.0 mmol/L混合氨基酸溶液，其中L-Leu∶L-Val∶L-Asp∶L-Glu的摩爾比為4∶1∶1∶1[17 - 19]，這些氨基酸及其比例與廣泛存在的重要的脂肽表面活性素相同。取氨基酸溶液0～0.400 mL補加3.00 mol/L NaCl水溶液至0.800 mL，加入0.200 mL三乙胺及1.00 mL標記試劑，混合后于75 ℃水浴中反應30 min。冷卻，過濾后用HPLC法記錄色譜圖，積分Leu標記物的峰面積，其量與積分面積關系見圖4A。考慮到堿性水解脂肽，在中和、定容后的鹽濃度(3.0 mol/L)及最大取樣量(0.800 mL)，控制反應體系中NaCl為2.40 mmol。反應后分層，下層為含鹽水相，上層為有機相，標記產物主要在有機相。

如要進行均相標記反應，NaCl不能超過0.40 mmol。在含0.40 mmol NaCl介質中反應后，HPLC法測定結果見圖4B。

圖4 亮氨酸的量與標記產物積分面積的關系 Fig.4 The Relationship between Leu amount and integration area of labeled derivatives A:with 2.40 mmol NaCl;B:with 0.40 mmol NaCl.

從回歸方程的線性相關系數看出，氨基酸的量與標記產物的積分面積有很好的線性關系，可以用于Leu的分析測定。因表面活性素中以Leu的比例最高，故以Leu來測定脂肽時靈敏度最高。高鹽濃度體系的回歸方程斜率大，靈敏度更高，而低鹽濃度的線性相關系數大，線性關系更好。為了測定低濃度的樣品，采用高鹽濃度的反應體系。

2.4 氨基酸的檢出限

測定6次無氨基酸的空白樣品，在Leu標記物平均保留時間21.18 min前后0.50 min內獲得積分面積作為測定的空白值(0.005、0.090、0.061、0.007、0.002、0.000)，分別計算平均值0.0275和標準偏差0.038，以3倍標準差作為檢出限，將積分面積0.143代入回歸方程計算得到檢出限是0.0162 μmol亮氨酸(2.12 μg)，相當于脂肽0.00405 μmol脂肽(4.16 μg)。標記反應時最多取0.800 mL水解后的中性溶液，故最低檢測濃度是5.2 mg/L的脂肽溶液。

2.5 樣品的脂肽含量

吸取0.500 mL脂肽提取液干燥、水解，同時吸取0.500 mL脂肽提取液加入0.500 mL標準氨基酸溶液(8.0 mmol/L Leu，相當于2.00 mmol/L脂肽)干燥、水解。經中和，定容至2.00 mL，取0.400 mL，加入3.00 mol/L NaCl溶液至0.800 mL，經過標記反應、冷卻、過濾、HPLC法測定。5次測定結果如表1所示。測定結果的重復性較好，相對標準偏差(RSD)<8%，回收率達92.6%。

根據每分子脂肽中含有7分子的氨基酸，其中4分子的亮氨酸，以及脂肽的平均分子量是1 028 Da，利用氨基酸的線性回歸方程，可以計算出脂肽提取液的脂肽量(0.253/4=0.0632 μmol)及濃度(0.0632/(0.500×0.400/2)=0.632 mmol/L=0.650 g/L)。

表1 脂肽樣品測定結果(n=5)

脂肽是一大類生物表面活性劑，結構上自然具有其多樣性，本方法是基于脂肽水解后產生亮氨酸，凡是水解后能產生亮氨酸的脂肽均可用此方法測定。因異亮氨酸與亮氨酸性質非常相近， HPLC法也難將其分開。故含有異亮氨酸的脂肽也能用該方法測定。為了消除其它含有氨基酸的肽類及蛋白質的干擾，可以通過洗滌的辦法加以除去[11]。但也有個別脂肽不含亮氨酸及異亮氨酸，這類脂肽不能用該方法進行測定。

不含亮氨酸及異亮氨酸的脂肽是：β-羥基脂肪酸成環環狀脂肽穩桿菌肽(Empedopeptin)(8肽)、β-氨基脂肪酸成環環狀脂肽伊枯草菌素(Irurins)類，α-氨基脂肪酸成環環狀脂肽Trapoxins；脂肪酸接環的環狀脂肽括棘白菌素類(Echinocandins)(6肽環)，環狀芽抱菌素(Circulocinα,β)；脂肪酸離環的環狀脂肽庫爾斯塔克素(Kurstakins)(4環肽/7肽)，A21978(10環肽/13肽)/達托霉素(Daptomycin)；線性脂肽螺旋形素(Spiroidesin)及線形脂肽TAN1511 A,B。

其它含有亮氨酸及異亮氨酸的脂肽占了大部分，它們是：β-羥基脂肪酸成環環狀脂肽，球園菌素(Globomycin)(5肽)，短小酸素(Pumilacidins)(7肽)，表面活性素(Surfactins)(7肽)，地衣素(Lichenysins)(7肽)，抗吸附素(Antiadhensin)(7肽)，環狀縮酚肽(Cyclodepsipeptide A)(7肽)，鹽桿菌素/異鹽桿菌素(Halobacillin/Isohalobacillin)(7肽)，節活性素(Arthrofactin)(10肽)；脂肪酸接環環狀脂肽的環狀芽抱菌素(Circulocinγ，δ)；脂肪酸離環環狀脂肽的豐原素(Fengycin)/制磷脂菌素(Plipastatins)(8環肽/10肽)，惡臭溶菌素(Putisolvins)(4環肽/12肽)，A54145(10環肽/13肽)的部分，雷莫拉寧(Ramoplanin)(16環肽/17肽)，多粘菌素 B(Polymixin)(7環肽/9肽)；線形脂肽TAN1511 C[2]。這類脂肽可以用本方法測定。

3 結論

脂肽中的氨基酸經2,4-二硝基氟苯標記，采用HPLC法分離，含量最多的亮氨酸標記物與其它氨基酸的標記物能夠很好分離，且氨基酸的量與對應目標物的積分面積有很好的線性關系，據此可以對氨基酸進行定量測定。大部分脂肽水解后能夠釋放出相應的氨基酸，故該方法也可以用于這類脂肽的定量測定。