基于DNA增強(qiáng)熒光法快速測定養(yǎng)殖用水中孔雀石綠

丁洪流， 沈福苗， 成玉梁， 謝云飛， 于 航， 姚衛(wèi)蓉， 郭亞輝*， 錢 和

(1.蘇州市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督綜合檢驗(yàn)監(jiān)測中心，江蘇蘇州 215000; 2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫 214000)

孔雀石綠(Nalachite Green,MG)是一種三苯甲烷類染料，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中曾被廣泛用作殺菌劑，但其具有毒性和致癌性，且毒性隨著暴露時(shí)間、溫度和濃度而增加[1 - 3]。但由于MG抗菌效果好、價(jià)格低廉，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中仍有違規(guī)使用的情況。因此，出于對(duì)人們健康的考慮，以及對(duì)水產(chǎn)品質(zhì)量的監(jiān)督，建立一個(gè)快速測定水體中MG的分析方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

國內(nèi)目前比較常見的MG檢測方法有拉曼光譜法[4 - 5]、液相色譜法[6]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[8 - 9]、其他光譜法[10 - 11]和電化學(xué)分析法[12 - 13]等。這些方法相對(duì)來說均具有較好靈敏度和較低的檢出限，但是也存在一些缺陷，比如拉曼光譜法納米粒子不穩(wěn)定，測定時(shí)受影響較大；液相色譜法前處理復(fù)雜，花費(fèi)時(shí)間長，檢測成本高；電化學(xué)方法則存在電化學(xué)修飾困難，操作難度大的問題。本文建立的DNA增強(qiáng)熒光法檢測時(shí)間短，只需1.5～2.5 h即可完成檢測，且操作簡單，可應(yīng)用于養(yǎng)殖水體快速檢測。MG本身熒光強(qiáng)度小，不能直接使用熒光光譜儀進(jìn)行檢測。已有報(bào)道[14]表明MG可結(jié)合到富含G堿基DNA形成的G -四聯(lián)體上，并且熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，故本工作在此原理基礎(chǔ)上，研究并建立了基于G -四聯(lián)體增強(qiáng)的熒光法快速檢測MG的新方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

F-4600熒光光譜儀(日本，Hitachi Co.Ltd)；M5酶標(biāo)儀(美國，Molecular Devices公司)。

本研究使用的DNA均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。DNA的儲(chǔ)備溶液用超純水制備，并根據(jù)波長260 nm處的紫外吸光度準(zhǔn)確定量濃度。孔雀石綠(MG)標(biāo)準(zhǔn)品(純度96%)，購自北京百靈威科技有限公司。NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液(PBS,0.2 mol/L，pH=6.6)：稱取1.064 g Na2HPO4，1.950 g NaH2PO4·2H2O，溶解定容至100 mL。Tris-HCl緩沖溶液(0.05 mol/L，pH=6.5，100 mmol/L K+)：稱取0.606 g Tris，0.745 g KCl，定容至100 mL，調(diào)節(jié)pH至6.5。Tris-HCl緩沖溶液(0.05 mol/L，pH=6.5，100 mmol/L Na+)：稱取0.606 g Tris，0.584 g NaCl，定容至100 mL，調(diào)節(jié)pH至6.5。上述所用試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為 Milli-Q超純水(18.2 MΩ·cm)。

水樣取自江南大學(xué)校內(nèi)小蠡湖。

1.2 檢測體系篩選

DNA增強(qiáng)熒光法快速檢測MG過程如下：在170 μL緩沖溶液中，依次加入10 μL 100 μmol/L DNA，20 μL 100 μmol/L MG溶液(線性實(shí)驗(yàn)中為20 μL不同濃度的MG標(biāo)準(zhǔn)溶液，實(shí)際樣品檢測時(shí)為20 μL水樣)，使檢測體系總體積為200 μL，劇烈混勻后，室溫靜置1 h，在630 nm激發(fā)波長下進(jìn)行熒光測定，激發(fā)和發(fā)射狹縫均設(shè)定為20 nm。分別改變緩沖溶液和DNA種類進(jìn)行上述檢測過程。熒光測定使用酶標(biāo)儀(M5，美國Molecular Devices公司)。

1.3 檢測限及實(shí)際樣品測定

改變檢測體系中MG濃度并進(jìn)行熒光檢測，并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用3倍噪聲值時(shí)的濃度作為檢測限。采用本研究檢測方法直接檢測。回收率測定：將取至小蠡湖的水樣作為基質(zhì)，向其中加入MG標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其濃度分別為0.5、1.0、5.0 μmol/L，配制成模擬水樣進(jìn)行檢測。具體檢測過程同上。

1.4 熒光強(qiáng)度及穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

采用0.5、1.0、5.0 μmol/L 3個(gè)濃度的MG溶液，分別改變DNA濃度，采用上述體系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。測定熒光強(qiáng)度。穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：H22 DNA(5 μmol/L),Tris-HCl緩沖溶液(0.05 mol/L，pH=6.5，100 mmol/L K+)與1 μmol/L MG形成的檢測體系產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度，通過放置不同時(shí)間檢測其熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果與討論

2.1 最佳檢測條件的選擇

表1羅列了本實(shí)驗(yàn)中采用的11種DNA序列，均為富G序列。3種緩沖溶液分別為磷酸鹽緩沖溶液(PBS)、含100 mmol/L K+Tris-HCl緩沖溶液和含100 mmol/L Na+Tris-HCl緩沖溶液。

表1 11種寡核苷酸(DNA)名稱及序列

圖1 分別由3種緩沖溶液及11種DNA序列組成的33種檢測體系測定孔雀石綠的相對(duì)熒光強(qiáng)度Fig.1 Relative fluorescence intensity of malachite green in 33 detection systems consisting of 3 kinds of buffer solutions and 11 kinds of DNA sequences

分別改變檢測體系中緩沖溶液種類以及DNA種類進(jìn)行DNA增強(qiáng)熒光法快速檢測，研究不同體系對(duì)MG熒光增強(qiáng)的影響。圖1所示為3種緩沖溶液及11種DNA序列檢測體系測定MG相對(duì)熒光強(qiáng)度結(jié)果三維柱狀圖。如圖所示，共有33個(gè)體系，每個(gè)體系分別對(duì)應(yīng)于一個(gè)空白對(duì)照，x軸上對(duì)應(yīng)的列為11種DNA分別與3種緩沖溶液形成的體系，y軸上對(duì)應(yīng)的行為3種緩沖溶液分別與11種DNA形成的溶液，包括三行對(duì)照。首先，分別從3種溶液進(jìn)行觀察。在PBS體系中，與DNA8形成的體系與MG結(jié)合顯示最強(qiáng)的熒光，其次是DNA7和DNA6，三者區(qū)別不大，最小的是DNA9。在含100 mmol/L Na+Tris-HCl緩沖溶液中，與DNA8形成的體系與MG結(jié)合具有最大的熒光強(qiáng)度，其次是DNA7和DNA6，三者區(qū)別不大，最小的是DNA9，這個(gè)結(jié)果與PBS體系類似。在含100 mmol/L K+Tris-HCl緩沖溶液中，與DNA11形成的緩沖體系測定MG具有最強(qiáng)熒光，其次是DNA5，最小的是DNA9。其次，縱觀11種DNA，DNA1、2、3、4、9、10與3種溶液形成的體系測定MG熒光強(qiáng)度具有一致性，說明這些DNA與MG作用產(chǎn)生熒光強(qiáng)度幾乎不受這3種緩沖溶液種類的影響。DNA6、7、8與含100 mmol/L K+Tris-HCl緩沖溶液形成的體系檢測熒光強(qiáng)度小于其它兩種溶液。DNA5和DNA11與含100 mmol/L K+Tris-HCl緩沖溶液形成的體系檢測熒光強(qiáng)度大于其它兩種溶液。從整體上來看，DNA11與含100 mmol/L K+Tris-HCl緩沖溶液形成的體系檢測MG具有最大的相對(duì)熒光強(qiáng)度。PBS和含100 mmol/L Na+Tris-HCl緩沖溶液與含100 mmol/L K+Tris-HCl緩沖溶液形成的體系具有顯著性差異，結(jié)合3種緩沖溶液的組成進(jìn)行對(duì)比分析，可以推測影響DNA與MG結(jié)合產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度的主要因素是鹽離子，且Na+和K+對(duì)不同種類的DNA的影響結(jié)果是不同的。

圖2 MG與DNA11-Tris-HCl(100 mmol/ K+)緩沖溶液體系檢測MG的熒光光譜圖對(duì)比Fig.2 Comparison of fluorescence spectra of MG and MG detected by DNA11-Tris-HCl(100 mmol/K+) buffer solution system

從上述篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得DNA11與含100 mmol/L K+Tris-HCl緩沖溶液形成的體系結(jié)合MG產(chǎn)生的熒光相對(duì)強(qiáng)度最大，故采用此檢測條件進(jìn)行后續(xù)檢測實(shí)驗(yàn)。圖2所示為MG自身熒光光譜圖與DNA11-Tris-HCl(100 mmol/L K+)緩沖體系檢測10 μmol/L MG的熒光光譜圖。可以觀察到添加了DNA緩沖體系后的MG溶液熒光強(qiáng)度顯著性增強(qiáng)(增強(qiáng)了約36倍)，這是由于H22 DNA在Tris-HCl(100 mmol/L K+)緩沖體系中易穩(wěn)定形成分子內(nèi)G -四聯(lián)體結(jié)構(gòu)[15]。文獻(xiàn)的報(bào)道[16]中也指出體外生物濃度(20 mmol/L)下的K+、Na+離子可以穩(wěn)定DNA形成的G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)，以前者的效果明顯[16]。對(duì)檢測溶液進(jìn)行激發(fā)和發(fā)射光譜掃描發(fā)現(xiàn)最大激發(fā)/發(fā)射波長為630/680 nm，其結(jié)果與MG自身最大激發(fā)和發(fā)射波長相近。

2.2 DNA濃度選擇及熒光穩(wěn)定性研究

對(duì)篩選出的DNA11-Tris-HCl體系進(jìn)行DNA濃度研究，選擇了3個(gè)濃度(0.5、1.0、5.0 μmol/L)MG，用不同濃度的DNA分別進(jìn)行檢測。結(jié)果如圖3所示，可以觀察得到3個(gè)濃度MG檢測結(jié)果具有相似性，隨著DNA濃度的增加，檢測體系熒光強(qiáng)度增大，DNA濃度在3.0 μmol/L之前時(shí)，熒光強(qiáng)度增大非常迅速，在5.0 μmol/L時(shí)基本達(dá)到穩(wěn)定。猜測DNA濃度增大熒光強(qiáng)度隨之增大的原因是隨著DNA濃度增大，DNA與MG比率也增大，溶液中DNA分子數(shù)增加，故而形成的G -四聯(lián)體結(jié)構(gòu)數(shù)量也增加，故而MG分子能更容易的，也更多的結(jié)合至G -四聯(lián)體上，從而熒光強(qiáng)度增大。結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果綜合考慮，DNA濃度選擇5.0 μmol/L。

圖3 DNA濃度優(yōu)化Fig.3 Optimization of DNA concentrations

采用DNA11-Tris-HCl-MG體系，DNA濃度5.0 μmol/L，MG濃度1.0 μmol/L，分別放置不同的時(shí)間測定熒光強(qiáng)度。結(jié)果顯示熒光強(qiáng)度在1 h之內(nèi)快速達(dá)到最大值，在30 h之內(nèi)基本保持恒定。

圖4 DNA增強(qiáng)熒光法檢測MG標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of DNA-enhanced MG fluorescence assay

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢測限

對(duì)于H22 DNA增強(qiáng)MG的熒光強(qiáng)度與MG濃度的相關(guān)性進(jìn)行了研究。配制0～6 μmol/L系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行熒光強(qiáng)度測定，結(jié)果如圖4所示。測定MG熒光強(qiáng)度與其濃度有很好的線性相關(guān)性，線性方程為：y=5206.902x+277.866，相關(guān)性系數(shù)(R2)達(dá)0.9941，線性范圍為0.1～6.0 μmol/L。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，以3倍噪聲值時(shí)的濃度作為檢測限，得到此方法的檢測限為0.083 μmol/L。

2.4 選擇性實(shí)驗(yàn)

選擇水產(chǎn)養(yǎng)殖常用的7種抗生素作為對(duì)照，分別為甲砜霉素、鹽酸四環(huán)素、羅紅霉素、氟苯尼考、氯霉素琥珀酸鈉、氯霉素、頭孢拉定。結(jié)果如圖5(A)所示，激發(fā)波長為630 nm，檢測結(jié)果差異非常顯著，可知此方法檢測MG具有非常好的選擇性。圖5(B)所示為干擾性實(shí)驗(yàn)，分別在MG標(biāo)準(zhǔn)溶液中添加等量的7種抗生素，結(jié)果顯示，MG分別添加7種抗生素后檢測的相對(duì)熒光強(qiáng)度與未添加的MG檢測結(jié)果相近，其熒光強(qiáng)度并未出現(xiàn)顯著性變化，故此方法用于檢測養(yǎng)殖水體中的孔雀石綠具有很好的實(shí)用性。

圖5 (A)7種抗生素及MG檢測的相對(duì)熒光強(qiáng)度;(B)MG及分別添加7種抗生素的MG的相對(duì)熒光強(qiáng)度Fig.5 (A)Relative fluorescence intensities of 7 kinds of antibiotics and MG;(B)Relative fluorescence intensities of MG and MG with 7 kinds of antibiotics added

2.5 實(shí)際樣品檢測及回收率測定

實(shí)際樣品用DNA增強(qiáng)熒光快速檢測法進(jìn)行檢測,結(jié)果未檢出。為測試該方法在實(shí)際樣品中的檢測能力，進(jìn)行了加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)。將取至小蠡湖的水樣作為基質(zhì)，向其中加入MG標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其濃度分別為0.5、1.0、5.0 μmol/L，配制成模擬水樣進(jìn)行檢測，如表2所示，回收率范圍為93.4%～119.3%。該方法有望應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測中。

表2 實(shí)際樣品檢測回收率表

3 結(jié)論

本文利用分子內(nèi)G -四聯(lián)體DNA與孔雀石綠結(jié)合會(huì)顯著性增強(qiáng)孔雀石綠熒光強(qiáng)度的原理，建立了一種快速、簡便、高效的養(yǎng)殖水體中MG的快速檢測方法。該方法基本無需前處理，且操作過程簡單快捷，檢測周期非常短，穩(wěn)定性好，抗干擾性強(qiáng)，可應(yīng)用于養(yǎng)殖水體MG快速檢測，對(duì)篩查MG具有現(xiàn)實(shí)意義。