典型品牌料酒風(fēng)味物質(zhì)的氣相色譜/質(zhì)譜指紋圖譜構(gòu)建及主成分分析和聚類分析

李茜云, 郭 明*,, 董穎娜, 吳榮暉

(1.浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 311300； 2.浙江農(nóng)林大學(xué)理學(xué)院，浙江杭州 311300)

料酒主要由黃酒基酒和香辛料組成。隨著人們生活水平的提高和食品行業(yè)的快速發(fā)展，料酒市場快速發(fā)展，市場上的調(diào)味料酒種類越來越多元化[1]。生產(chǎn)料酒主要是釀造方法和配制方法，市場上的料酒良莠不齊，雖有行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(SB/T 10416-2007)規(guī)范，但由于其中風(fēng)味成分復(fù)雜，很難通過簡單的感官評定和一般分析來判定風(fēng)味成分的質(zhì)量是否達(dá)標(biāo)。目前國內(nèi)已有一些料酒鑒定新技術(shù)，如陳燕清等[2]利用小波變換-可見-近紅外技術(shù)來鑒別品牌料酒；李英等[3]采用電子舌、色度儀和高效液相色譜對料酒的品質(zhì)進(jìn)行評價(jià)。這些技術(shù)方法對料酒的品牌鑒別和品質(zhì)評價(jià)具有重要的參考價(jià)值。

指紋圖譜技術(shù)能全面表征藥材內(nèi)在的化學(xué)成分種類和數(shù)量，被廣泛應(yīng)用于中草藥等復(fù)雜成分的鑒定及質(zhì)量評價(jià)。料酒為類似于中藥的復(fù)雜體系，既有黃酒醇、酯、醛類等成分[4]，又有香辛料中酚類、萜類等復(fù)雜成分[5,6]。應(yīng)用指紋圖譜技術(shù)可以全面反映料酒中的化學(xué)成分，提供豐富的鑒別信息，可有效對料酒的真實(shí)屬性及品質(zhì)進(jìn)行評價(jià)[7]，具有綜合、宏觀、模糊的非線性特點(diǎn)[8 - 10]，但是基于實(shí)驗(yàn)樣本量小、實(shí)驗(yàn)條件和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)有待優(yōu)化等條件限制，需要通過模式識別分析數(shù)據(jù)來驗(yàn)證指紋圖譜構(gòu)建的可行性，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)完善指紋圖譜體系以保證料酒的質(zhì)量品質(zhì)[11]。主成分分析和聚類分析為指紋圖研究中常見的兩種化學(xué)模式識別的方法，能以量化的形式對指紋圖譜的數(shù)據(jù)進(jìn)行多維綜合的統(tǒng)計(jì)分析并實(shí)現(xiàn)樣本歸類，減少單個(gè)指標(biāo)帶來樣本差異[12]。主成分分析[13]通過降維減少特征變量消除信息重疊，以較少互不相關(guān)的正交變量來表征料酒的多維信息[14]，但是考慮到主成分分析僅對貢獻(xiàn)率較大的成分進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，可能會存在信息缺失的問題，因此采用聚類分析作為佐證。聚類分析[15]能根據(jù)料酒數(shù)據(jù)源的相似性對其進(jìn)行分類，相對于指紋圖譜和主成分分析更加簡單、直觀且不會造成數(shù)據(jù)缺失。本文采用GC-MS聯(lián)用技術(shù)分析典型品牌料酒中醇、酯、萜等揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分，解析典型品牌料酒之間的共性，建立品牌料酒的指紋圖譜，并結(jié)合主成分分析和聚類分析從不同角度對料酒進(jìn)行品牌分類和鑒別。所建立方法不僅適用于廠家自身產(chǎn)品的質(zhì)量評價(jià)[16 - 17]，而且還可為市場質(zhì)檢提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

6890N-5975B安捷倫氣/質(zhì)聯(lián)用儀(安捷倫科技有限公司)；MTN-2800W氮吹濃縮裝置(天津奧特賽恩斯)；KQ-250B超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；1810D自動(dòng)雙重純水蒸餾器(上海申生科技有限公司)。

二氯甲烷(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；無水Na2SO4(分析純，上海虹光化工廠)。

14種典型品牌料酒樣品：購置10種市售浙江某典型品牌的不同類型料酒，分別為老酒料酒(5年)、蔥姜料酒Ⅰ、六年陳釀料酒、零添加料酒、蒸魚料酒、15°料酒、原釀五香料酒、蔥姜料酒Ⅱ、蔥姜料酒Ⅲ、料酒，按順序編碼為1～10號，這10種料酒用于建立標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜；購置4種市售不同批次的料酒，編碼11～14，利用建立的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜評判這4種料酒的品質(zhì)。

1.2 實(shí)驗(yàn)條件

1.2.1色譜條件色譜柱：Agilent HP-5毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；氦氣(99.999%)為載氣，恒定流速1.0 mL·min-1；進(jìn)樣口溫度250 ℃，不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣體積1 μL；升溫程序：初始溫度40 ℃，保持5 min；5 ℃·min-1升溫至60 ℃，保持2 min；4 ℃·min-1升溫至160 ℃，保持2 min；再以5 ℃·min-1升溫至250 ℃，保持3 min。

1.2.2質(zhì)譜條件電子轟擊離子源(EI)，離子源溫度230 ℃，電離能量70 eV，全掃描模式采集數(shù)據(jù)，掃描范圍為40～500 amu。

1.2.3樣品處理取10 mL料酒試樣于50 mL具塞玻璃管，加入二氯甲烷25 mL，超聲萃取20 min，經(jīng)分液漏斗得料酒有機(jī)相，重復(fù)提取兩次后合并。4 ℃條件下經(jīng)氮?dú)獯祾邼饪s到5 mL后，加入無水Na2SO4，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，備用。

1.3 數(shù)據(jù)分析

1.3.1共有峰的選擇將10種典型品牌的料酒導(dǎo)入到《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》中，設(shè)置S1為參照峰，根據(jù)各個(gè)成分相對保留時(shí)間的一致性進(jìn)行峰匹配，以多點(diǎn)校正消除各圖譜的時(shí)間誤差，自動(dòng)匹配后得到共有峰，并以平均數(shù)法生成對照指紋圖譜。

1.3.2相似度評價(jià)將生成的對照指紋圖譜與典型品牌料酒的內(nèi)在共有峰進(jìn)行相似性計(jì)算，以判斷料酒質(zhì)量的穩(wěn)定性和差異性。其中，夾角余弦法和相關(guān)系數(shù)法的計(jì)算如公式(1)和(2)所示。

(1)

式中：q為夾角余弦值；xKj、xLj為樣品K、L的第j個(gè)變量數(shù)據(jù)，j取1，2，…，p；p為變量數(shù)。

(2)

1.3.3化學(xué)計(jì)量學(xué)的數(shù)據(jù)分析基于14種料酒的492個(gè)所有色譜峰面積的樣本數(shù)據(jù)：運(yùn)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行主成分降維，得到相關(guān)矩陣的方差貢獻(xiàn)率以及主成分的得分；運(yùn)用SPSS 19.0進(jìn)行系統(tǒng)聚類，以得到其樹狀圖。運(yùn)用Origin 9.0對主成分得分作三維散點(diǎn)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

將樣品按1.2.3項(xiàng)下方法處理后，連續(xù)進(jìn)樣5次。以保留時(shí)間為18.859 min的峰作為參照峰，計(jì)算得到共有峰相對保留時(shí)間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)<0.54%，相對峰面積的RSD<2.7%，表明檢測系統(tǒng)的進(jìn)樣精密度良好；將樣品按1.2.3項(xiàng)下方法處理后，分別在0、4、12、18、24 h依次進(jìn)行檢測。以保留時(shí)間為18.859 min的峰作為參照峰，計(jì)算得到共有峰相對保留時(shí)間的RSD<0.18%，相對峰面積的RSD<2.3%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定；將樣品按1.2.3項(xiàng)下方法處理5份，進(jìn)樣5次。以保留時(shí)間為18.859 min的峰作為參照峰，計(jì)算得到共有峰相對保留時(shí)間的RSD<0.15%，相對峰面積的RSD<0.2%，表明其重復(fù)性試驗(yàn)較好。

2.2 10種典型品牌料酒指紋圖譜的建立

將10種某典型品牌料酒按1.2.3項(xiàng)下方法處理后，Origin軟件中1～10號10種典型品牌料酒的總離子流色譜圖如圖1所示。由圖1可知，在59 min內(nèi)，總出峰300多個(gè)，色譜峰較多，各個(gè)峰得到很好的分離，峰面積較大，峰形較好。利用中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)共提取確定29個(gè)共有峰，經(jīng)NIST 08 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫檢索以及人工圖譜解析(匹配度≤80%)，再結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，對各組分進(jìn)行鑒定，確定影響此料酒的風(fēng)味成分為醇、酯、醛、酚、烷、有機(jī)酸等化合物。鑒定的典型品牌料酒共有峰的詳細(xì)信息如表1所示。

圖1 10種典型品牌料酒總離子流(TIC)色譜圖 Fig.1 TIC chromatograms of 10 kinds of cooking wine of typical brand The serial number(1-29)of 29 common peaks are the same as those table 1.

表1 典型品牌料酒指紋圖譜共有峰組分分析結(jié)果

(續(xù)表1)

由表1可知，典型品牌料酒的29個(gè)共有峰的成分有醇類6種，酯類10種，脂肪酸2種，醛類2種，酰胺3種，酚類物質(zhì)2種，酮類物質(zhì)1種，雜烷物質(zhì)2種，萜類物質(zhì)1種。除黃酒的特征風(fēng)味成分苯乙醇外，含量較高的有十二醛二甲縮醛(1.46%～6.941%)、琥珀酸單乙酯(1.77%～11.19%)、D-焦谷氨酸叔丁酯(0.60%～8.14%)和棕櫚酸(2.26%～4.68%)。典型品牌料酒主要揮發(fā)性風(fēng)味成分是黃酒基酒發(fā)酵過程中有機(jī)酸與醇類物質(zhì)通過酵母酯化酶酯化作用生成的酯類物質(zhì)[18]和醛類物質(zhì)。棕櫚酸來自釀造過程中谷氨酸等氨基酸成分發(fā)酵產(chǎn)酸期生產(chǎn)的細(xì)胞膜脂肪酸[19]或是典型品牌料酒中添加的八角、丁香等香辛料的成分[20]。典型品牌料酒中檢測到的單萜烯物質(zhì)除冰片(龍腦)、α-松油醇外，還有桉葉油素、γ-萜品醇等，γ-萜品醇為姜的主要成分[21]；月桂、花椒、姜等多種香料中均含有桉葉油素[22-24]。

2.3 指紋圖譜特征峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積

比較共有峰，選定峰面積較大的(共有峰占總峰面積大于0.5%)13個(gè)共有峰作為指紋圖譜特征峰，苯乙醇作參照峰，將其保留時(shí)間和峰面積設(shè)定為1.0，計(jì)算其它特征峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積。10種典型品牌料酒特征峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積如表2所示。

表2 10種典型品牌料酒指紋圖譜特征峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積

Note:S1～S10 are the GC-MS fingerprint of 10 kinds of cooking wine of typical brand；R is the standard fingerprint；(*)is the relative peak area,which is different from the relative retention time.

2.4 10種典型品牌料酒指紋圖譜相似度分析

10種典型品牌料酒指紋圖譜相似度分析，計(jì)算結(jié)果如表3所示。

表3 10種典型品牌料酒GC-MS指紋圖譜相似度計(jì)算結(jié)果

由表3可知，典型品牌料酒10個(gè)樣品的相關(guān)系數(shù)法和向量余弦夾角法的數(shù)值均≤0.9400，說明該品牌不同種類的料酒具有較好的相似性，表明這10種料酒的風(fēng)味成分一致性較好，技術(shù)指標(biāo)穩(wěn)定，能綜合、準(zhǔn)確地反映典型品牌料酒的風(fēng)味情況?？梢宰鳛榕卸ㄔ摰湫推放屏暇频臉?biāo)準(zhǔn)。

2.5 典型品牌料酒標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的品牌鑒別

為了驗(yàn)證指紋圖譜的合理性和應(yīng)用性。將4種未知品牌的料酒按1.2.3方法處理后，得到的譜圖和數(shù)據(jù)同標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的峰形和特征峰的相似度數(shù)據(jù)比對，判定4種不詳廠家和品牌的料酒品牌和質(zhì)量盲評。結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，從峰的總數(shù)與峰面積可看出，13號樣品的峰面積和峰的數(shù)目與標(biāo)準(zhǔn)樣品比較相似，11、12和14號樣品的峰的數(shù)目與峰面積與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜存在一定差異。

圖2 4種料酒與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的色譜圖對比 Fig.2 Comparison of chromatograms of 4 kinds of cooking wine with standard fingerprint The serial number(1-29)of 29 common peaks are the same as those table 1.

圖3 前三個(gè)主成分的3D得分圖Fig.3 3D scores of the first three principal components

對標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜與4種料酒的特征峰采用夾角余弦法和相關(guān)系數(shù)法進(jìn)行計(jì)算，13號樣品的夾角余弦和相關(guān)系數(shù)為0.9947和0.9911，高于閾值0.9400，證實(shí)為該品牌的料酒。11號樣品的夾角余弦和相關(guān)系數(shù)僅為0.5504和0.0123，12號樣品的夾角余弦和相關(guān)系數(shù)為0.4843和0.2017，14號樣品的夾角余弦和相關(guān)系數(shù)為0.4093和-0.0549，3個(gè)檢測樣品均遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于閾值0.9400，鑒別不是該典型品牌的料酒。這與指紋圖譜的判定結(jié)果完全相符。

2.6 14種料酒主成分分析的品牌鑒別和分類

將14種料酒通過中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)的匹配數(shù)據(jù)后，按照保留時(shí)間將樣品所有峰面積列出，沒有的色譜峰的峰面積為0，共得到492個(gè)所有色譜峰的相對峰面積。運(yùn)用SPSS 19.0以所有色譜峰面積為變量進(jìn)行主成分總體分析，通過降維[25]來弱化變量間自相關(guān)性引起的誤差從而得到互不相關(guān)的主成分的特征值、貢獻(xiàn)率、累計(jì)貢獻(xiàn)率[26]以及得分，從而實(shí)現(xiàn)對料酒品質(zhì)的綜合評價(jià)。降維得到的前3個(gè)主成分(累積貢獻(xiàn)率53.43%)的得分在三維空間的投影情況如圖3所示。

圖3可將這14種料酒分為2類，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、13為一類，11、12、14為另一類。即主成分分析和指紋圖譜的檢測結(jié)果一致。

圖4 14種料酒聚類分析譜系圖Fig.4 Cluster analysis spectrum map of 14 kinds of cooking wine

2.7 14種料酒聚類分析的品牌鑒別和分類

以492個(gè)所有峰的相對峰面積為變量，運(yùn)用SPSS 19.0軟件以余弦距離為度量標(biāo)準(zhǔn)，采用組間連接的方法對14個(gè)樣品進(jìn)行聚類分析，再次對料酒進(jìn)行品牌驗(yàn)證。其結(jié)果如圖4所示。從圖4譜系圖可見，14種料酒在類間間距D=12.5時(shí)，14種料酒大致可以分為4類。第一類為3、7、8、1、4、2、10、9、5、6、13，第二類為11，第三類為12，第四類為14。以上結(jié)果驗(yàn)證了指紋圖譜相似度的計(jì)算結(jié)果和主成分的計(jì)算結(jié)果，即10種典型品牌料酒和13為相同品牌，其他三種料酒不屬該品牌料酒。由此也驗(yàn)證了指紋圖譜和主成分分析的合理性。

3 結(jié)論

采用品牌料酒標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜共有峰成分來確定料酒的風(fēng)味物質(zhì)，計(jì)算特征峰組的相似度均達(dá)到了0.9400以上，說明標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的色譜圖和數(shù)據(jù)可以作為典型品牌料酒的質(zhì)量分析與鑒別的依據(jù)。中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)能夠分析影響料酒的風(fēng)味成分，主成分分析和聚類分析可以對品牌進(jìn)行鑒定和分類，且主成分分析和聚類分析即使在共有峰很少或沒有共有峰的情況下，仍可以判別酒的真?zhèn)尾⒎诸悺?種方法相互印證、相互補(bǔ)充，使品牌鑒別和質(zhì)量評價(jià)更加可靠、更加全面、更加科學(xué)。