基于分子印跡技術檢測雞肉中16種喹諾酮藥物殘留

王 瑞， 徐 軍， 張瑞良， 王文靜， 王 磊, 趙 霞， 楊艷菲， 李 琳*

(安徽農業大學動物科技學院，安徽合肥 230036)

喹諾酮類藥物(QNs)是于20世紀60年代出現的一類人工合成抗菌藥，主要通過抑制細菌DNA復制而發揮抗菌作用，具有抗菌譜廣、抗菌作用強、口服吸收好、使用方便、價格低廉等優點，被廣泛應用于畜禽和水產養殖業。隨著QNs在臨床上的不合理或過量使用，易引起潛在的致癌、致畸、致突變作用，其在環境中的殘留問題也越來越顯著[1 - 3]。基于環境與消費者安全考慮，歐盟、美國食品藥物管理局和中國農業部[4 - 6]等都制定了QNs在動物源性食品中的最高殘留限量(MRL)。因此，加強對QNs的殘留監測，建立快速、靈敏、可靠的定量檢測方法非常必要。

雞肉樣品基質復雜，低濃度的目標物易被干擾，導致提取和凈化不徹底，因此對樣品前處理技術要求較高。固相萃取[7 - 8]是常用的樣品前處理方法。傳統固相萃取的目標物與吸附劑之間是非特異性的，填料選擇性不強，常發生與雜質共萃取的現象，影響后續分析[9 - 10]。而分子印跡固相萃取(MISPE)是以高選擇性的分子印跡聚合物(MIPs)為固相萃取填料，MIPs具有選擇性地分離復雜樣品中的痕量分析物、有效去除雜質干擾、提高分析的準確度和靈敏度、穩定性好、能夠重復使用等優點[11 - 13]。Tang等[14]采用MISPE技術，以恩諾沙星為模板合成中空的MIPs，能夠有效去除復雜基質干擾，靈敏度高。Urraca等[15]建立MISPE-LC-MS/MS法僅對雞肉中環丙沙星、恩諾沙星、諾氟沙星、沙拉沙星、洛美沙星、單諾沙星6種QNs進行準確測定。本文選取了16種典型的喹諾酮類藥物作為研究對象，通過優化MISPE條件，建立了一種基于MISPE-UPLC-MS/MS快速測定雞肉中喹諾酮類藥物殘留的分析方法，可應用于實際樣品的檢測，為相關藥物的快速檢測提供重要參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Acquity UPLC-Xevo TQ MS超高效液相色譜-串聯質譜儀及固相萃取裝置(美國，Waters公司)；SupelMIPTM-SPE(25 mg/3mL，美國Sigma公司)；GHP針式濾膜(0.22 μm，美國Pall公司)。

氧氟沙星(Ofloxacin，純度99%)、諾氟沙星(Norfloxacin，純度99%)、培氟沙星(Pefloxacin，純度99%)、環丙沙星(Ciprofloxacin，純度99%)、洛美沙星(Lomefloxacin，純度97%)、恩諾沙星(Enrofluxacin，純度99%)、達氟沙星(Danofloxacin，純度93%)、沙拉沙星(Sarafloxacin，純度97%)、二氟沙星(Difluoxacin，純度98%)、吡哌酸(Pipemidic Acid，純度99%)、麻保沙星(Marbofloxacin，純度99%)、依諾沙星(Enoxacin，純度99%)、氟羅沙星(Fleroxacin，純度99%)、奧比沙星(Orbifloxacin，純度99%)、惡喹酸(Oxolinic acid，純度98%)、吡咯酸(Piromidic acid，純度98%)均購自于德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。尤利沙星(Ulifloxacin，純度95%)、加替沙星(Gatifloxacin，純度98%)均購自于加拿大Toronto Research Chemicals公司。乙酰丙嗪(Acepromazine，純度98%)、甲苯噻嗪(Xylazine，純度98%)、甲氧芐啶(Trimethoprim，純度98%)、磺胺間甲氧芐啶(Sulfamamonomethoxine，純度98%)、磺胺對甲氧嘧啶(Sulfameter，純度98%)、泰樂菌素(Tylosin，純度98%)、麥迪霉素(Midecamycin，純度98%)、羅紅霉素(Roxithromycin，純度98%)、紅霉素(Erythromycin，純度98%)均購自于上海安譜實驗科技股份有限公司?；前废醣?Sulfanitrn，純度98%)、磺胺噻唑(Sulfathiazole，純度98%)、吉他霉素(Stereomycin，純度98%)、萘啶酸(Nalidixic acid，純度98%)、氟甲喹(Flumequine，純度98%)均購自于美國U.S.Pharmacopeia公司。甲醇、乙腈均為色譜純(德國CNW科技公司)；甲酸為色譜純(北京迪馬科技有限公司)；乙酸、氨水為分析純(國藥集團化學試劑有限公司)。

1.2 標準溶液的配制

準確稱取上述16種喹諾酮類藥物的標準品，用甲醇溶解并配制質量濃度為100 μg/mL的標準儲備液，于4 ℃的冰箱中冷藏保存；使用時依次用水稀釋至相應質量濃度，根據需要用流動相逐級稀釋，配制適當質量濃度的16種喹諾酮類混合標準工作液，且現用現配。

1.3 液相色譜條件

Acquity LC BEH C18柱(100×2.1 mm，1.7 μm,美國Waters公司)；柱溫35 ℃；流速0.3 mL/min；進樣量5.0 μL；流動相0.1%甲酸水溶液(A)和乙腈(B)；梯度洗脫程序:0～2 min，10%B；2～3 min，10%～15%B；3～4 min，15%～55%B；4～5 min，55%～80%B；5～5.5 min，80%～10%B；5.5～7 min，10%B。

1.4 質譜條件

電噴霧離子源，正離子模式(ESI+)；質譜多反應監測模式(MRM)檢測；毛細管電壓2 700 V；離子源溫度150 ℃；霧化氣流量1 000 L/h；錐孔氣流量50 L/h；碰撞氣流量0.24 L/h；霧化室溫度450 ℃。采集參數見表1。

表1 保留時間與質譜參數

(續表1)

*Quantitative ion.

1.5 樣品前處理

準確稱取2 g均質后的雞肉樣品，置于50 mL離心管中，加入8 mL 0.5 mol/L KH2PO4溶液，以8 000 r/min離心5 min，收集上清于50 mL離心管中，用8 mL溶液重復提取一次，合并提取液。MISPE柱經2 mL甲醇、2 mL水活化后，加入4 mL提取液，經2 mL水、2 mL乙腈、2 mL 2%乙酸乙腈、2 mL 0.1%氨水溶液淋洗，3 mL 5%氨化甲醇溶液洗脫，在優化條件下進行凈化，收集洗脫液，于40 ℃下氮氣吹至近干，用1 mL 0.1%甲酸-乙腈(體積比9∶1)溶解殘留物，過0.22 μm濾膜，供UPLC-MS/MS檢測。

2 結果與討論

2.1 MISPE柱凈化條件的優化

2.1.1上樣液體積的選擇本實驗對上樣液的體積進行了研究。稱取2 g空白雞肉樣品，添加10 μg/L混合標準工作溶液，分別以體積為4 mL、8 mL、16 mL的提取液上樣，通過UPLC-MS/MS測定各藥物的回收率。當上樣體積為16 mL時，各藥物的回收率最低，在45.9%～85.8%之間；而當上樣體積為4 mL和8 mL時，回收率在70.4%～110.5%和60.3%～110.4%，均滿足藥物殘留檢測要求。由于雞肉樣品經磷酸鹽溶液提取后，樣品溶液中含有一定的雜質，且隨著上樣體積的增加，而基質效應會對實驗結果造成一定的影響，導致后續凈化不徹底[16]。因此，本實驗選擇4 mL提取液作為上樣溶液。

2.1.2淋洗和洗脫條件的選擇為了保證MISPE柱的最優效果，本實驗系統比較了不同比例氨水溶液、乙酸乙腈、氨化甲醇溶液對16種QNs的淋洗與洗脫特征。對MISPE進行淋洗時，2%乙酸乙腈、0.1%氨水洗脫能力較弱，對于各藥物的淋洗率均低于5%；5%乙酸乙腈、0.5%氨水、2%氨化甲醇洗脫能力逐漸增強，藥物的淋洗率分別為23.8%～44.4%、33.1%～53.7%、58.4%～69.1%；5%氨化甲醇洗脫能力最強，各藥物的淋洗率均高于72.3%；樣品流經MISPE柱后，先用水淋洗，可有效去除樣品中極性較大的雜質，以降低對MS/MS檢測中的基質效應。不僅要考慮淋洗液能夠洗掉柱子上的雜質、干擾物及提高MISPE柱子的選擇性，同時還要保證回收率的要求，所以本實驗最終選擇水、乙腈、2%乙酸乙腈、0.1%氨水為淋洗條件。

2.1.3洗脫液體積的選擇本實驗研究了不同體積(2～5 mL)的洗脫液對16種喹諾酮類藥物回收率的影響。當洗脫液的體積由2 mL增加至3 mL時，喹諾酮類各藥物的回收率均有所提高；當洗脫液體積為3 mL時，回收率為84.3%～105.9%，各藥物的都能夠獲得較高的回收率。當洗脫液的體積由3 mL增加至5 mL時，各藥物的回收率均呈下降趨勢。為了達到理想的回收率，又減少洗脫溶液中的雜質量，本實驗最終選擇洗脫液的體積為3 mL。

2.2 MISPE柱吸附特性的測定

2.2.1MISPE柱對于不同類藥物的吸附選擇性分別將含有2種鎮靜劑(乙酰丙嗪、甲苯噻嗪)、5種磺胺類(磺胺間甲氧芐啶、磺胺硝苯、磺胺噻唑、甲氧芐啶、磺胺對甲氧芐啶)、5種大環內酯類(泰樂菌素、麥迪霉素、羅紅霉素、紅霉素、吉他霉素)及16種目標分析物的KH2PO4溶液加入MISPE柱，依次用水、乙腈、2%乙酸乙腈、0.1%氨水溶液對MISPE柱進行淋洗及5%氨化甲醇進行洗脫，并且收集上樣液、淋洗和洗脫液，測定各藥物的回收率。由表2可見，上樣液經MISPE柱后，鎮靜劑、磺胺類、大環內酯類不能被有效保留，有20.5%～77.5%直接流出；經水、乙腈、2%乙酸乙腈、0.1%氨水溶液淋洗后，殘留的非目標物均被淋洗下來，而目標物的回收率極低；當采用5%氨化甲醇洗脫時，僅16種QNs被洗脫，未發現非目標物。其原因可能是鎮靜劑、磺胺類、大環內酯類藥物的化學結構與QNs藥物的化學結構相差較大，不易與MIPs重模板相互作用與結合，因而在上樣、淋洗過程中就直接被淋洗下來。

表2 2種鎮靜劑、5種磺胺和5種大環內酯類藥物在上樣、不同淋洗和洗脫條件下的回收率

"-"：non detection.

2.2.2MISPE柱對于QNs的吸附選擇性實驗研究了MISPE柱對于喹諾酮此類藥物的吸附選擇性。將含有16種目標分析物和4種喹諾酮類藥物(氟甲喹、惡喹酸、萘啶酸、吡咯酸)的KH2PO4溶液加入MISPE柱，同上述操作。由表3可見，上樣液流經MISPE柱后，所有的藥物被有效的保留在MISPE柱上；4種QNs經淋洗操作后，均在乙腈處被大量的洗脫下來，且各藥物的淋洗率均在80%以上，而16種目標物的回收率極低；當采用5%氨化甲醇洗脫時，僅16種QNs目標分析物被洗脫，未發現其他4種QNs。林峰等[17]報道了脫羧峰是喹諾酮分子含有羧基基團的表征，脫羧后哌嗪環斷裂重排更是喹諾酮藥物特有的

表3 4種喹諾酮類藥物在上樣、不同淋洗和洗脫條件下的回收率

"-"：non detection.

結構表征。4種喹諾酮類藥物流經MISPE柱后可以被有效的保留在柱上的原因可能是它們與16種目標物的側鏈上均含有羧基，其能夠與MIPs上位點相結合；但經水和乙腈淋洗后，又被大量洗脫下來的原因可能為這種結合能力較弱，可以視為無特異性吸附；推測可能是由于4種喹諾酮類藥物不具有哌嗪等含氮堿基活性官能團；而16種目標分析物側鏈上的這種活性官能團是其與MIPs發生特異性結合位點。

2.3 MISPE凈化雞肉中QNS殘留-UPLC-MS/MS檢測方法的評價

采用空白基質添加標準曲線定量，真實反映樣品中喹諾酮類藥物的含量。用質量濃度為0.25、0.5、1.0、2.0、5.0、10、20、50、100、200 μg/L的16種混合標準溶液進行定量分析，以待測物的定量離子峰面積(Y)作為縱坐標，以待測物的質量濃度(X)作為橫坐標，繪制標準曲線，各藥物在0.25～200 μg/L質量濃度范圍內線性關系良好，相關系數(r)均>0.99。以3倍信噪比(S/N)為檢出限、10倍信噪比為定量限，16種喹諾酮類藥物的檢出限與定量限分別為0.08 μg/kg和0.25 μg/kg。

在雞肉樣品中添加0.25、2.5、5.0 μg/kg 3個水平的標準物質，每個水平做6個平行試驗，重復3次。平均回收率為88.6%～101.9%，相對標準偏差(RSD)為2.9%～10.5%。16種喹諾酮類藥物的回歸方程與相關系數、添加回收率與精密度見表4。

表4 雞肉樣品中16種喹諾酮類藥物的回歸方程與相關系數、添加回收率與精密度

(續表4)

2.4 基質效應

本研究在空白雞肉樣品中添加不同質量濃度的混合標準溶液，以各藥物的峰面積對質量濃度繪制標準曲線，MISPE柱富集凈化的雞肉組織中16種喹諾酮類藥物，各藥物的基質標準曲線與試劑標準曲線的斜率比為81.9%～108.5%。表明，樣品經MISPE柱凈化后，基質效應對分析結果無明顯影響。

2.5 實際樣品測定

本研究建立的方法對安徽省某屠宰場采集的80份雞肉樣品進行檢測。結果表明，有3份雞肉樣品中含有諾氟沙星。檢測出的殘留值為3.37、4.42和6.55 μg/kg。和國家標準(GB/T 20366-2006)[18]方法檢測結果基本一致，且本方法選擇性更好、靈敏度更高。

3 結論

建立了MISPE-UPLC-MS/MS測定雞肉中16種QNs殘留的方法，同時優化了萃取條件，使得所有藥物得到了良好的分離，有效降低了基質效應，提高了方法的選擇性，并且操作簡單、靈敏度高。