超高效液相色譜-高分辨質譜分析大鼠肝微粒體中厚樸酚與和厚樸酚的體外代謝

黃 彧， 劉春明*， 吳 桐， 王樂奇， 侯萬超， 李賽男

(長春師范大學中心實驗室，吉林長春 130032)

肝臟是機體中參與代謝藥物的重要器官，它含有大量與藥物代謝密切相關的重要酶系。其中，最重要的Ⅰ相反應酶是細胞色素P450酶(CYP450)，人體內幾乎70%的藥物由其代謝[1]。大量研究表明，CYP450亞型酶對藥物的代謝顯示出特異性，這使得我們可以根據CYP450亞型酶的特異性抑制劑來確定藥物的代謝途徑。由于許多藥物的相互作用是通過提供藥物誘導或抑制CYP450酶的活性，使其它藥物的代謝增強或減弱所導致的，所以了解藥物在CYP450酶中的代謝情況，并確定對應的代謝酶亞型顯得非常重要[2]。

厚樸對食積氣滯、腹脹便秘等疾病有治療作用[3]。在2015年版《中國藥典》中有近100種中藥制劑配方是將其作為主要成分的，例如小兒瀉痢片、小兒豉翹清熱顆粒、木香順氣丸等[4]。厚樸樹皮中含木脂體類化合物厚樸酚(Magnolol)、和厚樸酚(Honokiol)等，還有單萜木脂體類化合物、生物堿、揮發油等，而它的主要藥理活性成分是厚樸酚、和厚樸酚[5]。有研究表明厚樸酚可能是預防骨質紊亂如骨質疏松癥的候選藥物[6]。厚樸及厚樸中的兩種藥效成分厚樸酚與和厚樸酚對羥自由基和過氧化氫有清除作用，并且相對于厚樸酚、和厚樸的抗氧化能力更強[7]。王俊俊通過和厚樸酚能夠降低大鼠Ⅱ型糖尿病模型的血糖血脂、增強肝臟抗氧化酶、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活力等指標發現了和厚樸酚具有抗糖尿病的效果[8]。和厚樸酚還可以通過阻止丙型肝炎病毒(HCV)細胞的侵入和復制而抑制HCV的傳播，是治療丙型肝炎的潛在藥物[9]。在抗菌方面，有報道證明厚樸酚與和厚樸酚的聯用對體外耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)有效[10]。關于厚樸酚與和厚樸酚藥效作用的研究比較豐富，但在CYP450亞型酶(CYP1A2，2C9，2C19，2D6，2E1和3A4)中代謝機理的研究還沒見相關的報道。本文系統地研究了厚樸酚與和厚樸酚在大鼠肝微粒體(RLMs)中的體外代謝[11]，并應用超高效液相色譜-高分辨質譜(UPLC-HRMS)分析鑒定了主要代謝物。通過使用特異性抑制劑鑒定了指導厚樸酚與和厚樸酚在大鼠肝微粒體中代謝的CYP450亞型酶。本研究旨在為厚樸酚與和厚樸酚體外代謝的進一步研究及臨床合理化用藥提供新的實驗依據。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Thermo fisher U3000超高效液相色譜儀(德國，Thermo Fisher Scientific)，配置在線脫氣機、四元梯度泵、柱溫箱、自動進樣器；Thermo Scientific Q Extractive 質譜儀(德國，Thermo Scientific)；Xcalibur 3.2軟件；Sanorius BSl10S 分析天平(德國，Sanorius)；Sigma 1-14離心機(德國，Sigma)；DW-86L486型超低溫冰箱(中國Haier公司)。

厚樸酚、和厚樸酚(上海源葉生物科技有限公司，批號分別為：KS0912CB14，T28O6B5149)。槲皮素、α-萘黃酮、奎尼定、氯美噻唑、花椒毒素、噻氯匹定、酮康唑(梯希愛(上海)化成工業發展有限公司，批號分別為：83N2O-AR，UEESA-IH，WEODL-RE，WBHWE-F8，7OMXF-TL，RH58M-OI,ZJUZI-PM)。NADPH再生系統和磷酸鹽緩沖溶液(PBS)(Solarbio公司，批號分別為：721L023，20161212)。色譜純甲醇、乙腈以及甲酸(美國Fisher Scientific公司)。實驗用水由Milli-Q純水系統制備。

1.2 動物

雄性SD大鼠(混合)肝微粒體購自瑞德肝臟疾病研究所(上海)有限公司，蛋白質量濃度為20 mg/mL(批號：JPXY)。

1.3 實驗方法

1.3.1厚樸酚與和厚樸酚的體外代謝150 μL酶反應系統[12]，含有0.5 mg/mL肝微粒體蛋白，100 mmol/L PBS(pH=7.4)，NADPH再生系統(終濃度為3.3 mmol/L葡萄糖-6-磷酸，1.3 mmol/L NADP+，0.4 U/mL葡萄糖-6-磷酸脫氫酶和3.3 mmol/L MgCl2)以及10 μL厚樸酚、和厚樸酚(終濃度為50 mmol/L)。RLMs與厚樸酚、和厚樸酚在37 ℃下預溫育5 min后，通過加入NADPH再生系統啟動反應。37 ℃孵育90 min。

1.3.2厚樸酚與和厚樸酚代謝酶亞型的特異性抑制劑探針法利用CYP450亞型酶的特異性抑制劑來確定厚樸酚與和厚樸酚的CYP450代謝酶亞型[13]。抑制劑濃度及其靶點具體如下：0.01 mmol/L槲皮素(CYP2C)，0.02 mmol/L花椒毒素(CYP2A6)，0.02 mmol/L奎尼定(CYP2D6)，0.02 mmol/L氯美噻唑(CYP2E1)，0.01 mmol/L酮康唑(CYP3A)，0.025 mmol/Lα-萘黃酮(CYP1A2)，0.02 mmol/L噻氯匹定(CYP2B6)[8 - 11]。這些化合物用于分析厚樸酚與和厚樸酚在RLMs中的代謝途徑。

將用于溶解厚樸酚、和厚樸酚的溶劑的孵育溶液(甲醇)用作陰性對照[14]，將上述特定抑制劑用作陽性對照。其他孵育條件與“1.3.1”部分中描述相同。比較代謝物含量的變化。

1.3.3樣品處理加入150 μL冰乙腈溶液終止反應。渦旋樣品，4 ℃、13 000 r/min離心10 min。上清液供UPLC-HRMS分析。

1.3.4色譜和質譜條件使用Thermo Hypersil Gold C18色譜柱(100×2.1 mm，1.7 μm)分離厚樸酚、和厚樸酚以及代謝產物。流動相由0.1%甲酸(A)和乙腈(B)組成。線性梯度洗脫程序：0～5 min，5%B；5～8 min，5%～30%B；8～15 min，30%～52%B；15～20 min，52%～72%B。柱溫：20 ℃。采用全掃描和選擇反應監測(SRM)方式鑒定：噴霧電壓設定為-4.5 kV，毛細管溫度為350 ℃，鞘氣壓為35 psi，輔助氣壓為10 psi。使用以下參數進行一級質譜(MS)和二級串聯質譜(MS/MS)數據采集：分辨率17 500，碎裂電壓NCE為30，掃描范圍m/z100～1 200。

2 結果與討論

2.1 厚樸酚代謝產物及代謝途徑的確定

使用UPLC-HRMS分析CYP450反應體系中厚樸酚的代謝產物，與空白滅活的CYP450反應體系相比，在總離子流圖中發現了5個明顯的新增質譜峰。原型化合物厚樸酚及其代謝產物的MS2數據見表1。其中，厚樸酚的保留時間tR為18.27 min，分子離子峰[M-H]-(m/z=265.1235)。MS2中產生了m/z=247.1127的碎片離子和一個水分子碎片離子，這與Li等[15]的報道一致。

表1 厚樸酚及其主要代謝物的UPLC-MS/MS數據

圖1 厚樸酚代謝產物M1的質譜碎裂機理Fig.1 Mechanism of mass spectrometry fragmentation of Magnolol metabolite M1

代謝產物M1準分子離子[M-H]-為m/z295.0977，保留時間tR為11.22 min，結合厚樸酚結構，推測其為厚樸酚端位烯烴氧化產物。它在MS2中產生m/z277.0871、251.1078、233.0972、231.0812、209.0608等碎片離子，它們分別為代謝產物M1脫去一分子水；脫去一分子水、一個羰基以及發生了加氫還原；脫去兩個羥基和一個羰基；脫去兩分子水和一個羰基；脫去一個丙烯基、一個羰基以及一分子水。MS碎裂過程如圖1所示，MS2如圖2(a)所示。代謝產物M2準分子離子[M-H]-為m/z299.1291，保留時間tR為11.78 min。結合厚樸酚結構，推測是厚樸酚的末端雙鍵單氧化和單羥基化產物。這在MS2中產生了m/z239.1075、221.0968、133.0646和93.0331碎片離子，分別是代謝產物M2損失了兩個羥基；丟掉了兩個羰基和一個水分子；去掉了兩個羰基，一個水分子和環斷裂；去掉了兩個羰基，一個水分子，一個丙烯基團，并發生了環斷裂。MS2如圖2(b)所示。代謝產物M3分子離子[M-H]-(m/z=281.1184)的保留時間tR為13.55 min，推測可能是厚樸酚苯環單羥基化產物。在MS2中產生m/z263.1079、245.0970、133.0646等碎片離子，分別為代謝產物M3丟失一分子水；丟失兩分子水；丟掉一分子水并發生環中裂。MS2如圖2(c)所示。代謝產物M4準分子離子[M-H]-為m/z279.103，保留時間tR為14.91 min，結合厚樸酚結構，推測是厚樸酚端位烯烴發生了氧化反應。它在MS2中產生m/z261.092、233.0968、209.0601等碎片離子，它們為代謝產物M4分別脫去一分子水；脫去一分子水及羰基；脫去一分子水以及發生環中裂。其MS2圖見圖2(d)。代謝產物M5準分子離子[M-H]-為m/z285.1502，保留時間tR為17.89 min，結合厚樸酚結構，推測其為厚樸酚末端雙鍵單羥基化和苯環單羥基化產物。它在MS2中產生m/z267.1967、223.2063等碎片離子，它們分別為代謝產物M5脫去一分子水；脫去一分子水和羰基。其MS2圖見圖2(e)。

圖2 厚樸酚代謝產物二級質譜圖 Fig.2 Secondary cascade mass spectrometry of Magnolol metabolites (a)M1;(b)M2;(c)M3;(d)M4;(e)M5.

2.2 和厚樸酚代謝產物及代謝途徑的確定

使用UPLC-HRMS分析了和厚樸酚在CYP450反應體系中的代謝產物，與空白滅活的CYP450反應體系比較，在總離子流圖中主要發現四個新增質譜峰(圖略)。原型化合物和厚樸酚以及各代謝產物對應的二級串聯質譜數據列于表2中。其中和厚樸酚，保留時間tR為31.62 min，化合物準分子離子[M-H]-(m/z=265.1235)。它在MS2中產生m/z237.1285和224.0838碎片離子，它們分別代表和厚樸酚的去羰基化以及和厚樸酚的丙烯基碎片離子去質子化，這與Li等[15]報道一致。

表2 和厚樸酚及其主要代謝物的UPLC-MS/MS數據

圖3 和厚樸酚代謝物M1的質譜碎裂機理Fig.3 Mass spectrometry fragmentation mechanism of Honokiol metabolite M1

代謝產物M1準分子離子[M-H]-為m/z295.0977，保留時間tR為17.44 min，結合和厚樸酚結構，推測其為和厚樸酚端位單羥基化產物。它在MS2中產生m/z267.0664、254.0584、251.0711等碎片離子，它們是代謝產物M1分別脫去一個乙烯基；脫去一個乙烯基及一分子水；脫去丙烯基。質譜碎裂過程如圖3所示。代謝產物M2準分子離子[M-H]-為m/z279.1026，保留時間tR為20.07 min，結合和厚樸酚結構，推測其為和厚樸酚端位烯烴氧化產物。它在MS2中產生m/z265.0870、251.0712、237.0554、210.0680碎片離子，它們是代謝產物M2分別脫去一個亞甲基；脫去一個乙烯基；脫去一個丙烯基；脫去一個丙烯基以及一個羰基。代謝產物M3準分子離子[M-H]-為m/z257.1759，保留時間tR為25.57 min，結合和厚樸酚結構，推測其為和厚樸酚發生單羥基化以及加氫還原反應。它在MS2中產生m/z239.1651、195.1747等碎片離子，它們分別為代謝產物M3脫去一分子水；脫去一個羰基及兩個羥基。代謝產物M4準分子離子[M-H]-為m/z285.2075，保留時間tR為32.40 min，結合和厚樸酚結構，推測其為和厚樸酚發生羥基化和加氫還原反應的代謝產物。它在MS2中產生m/z267.1968、223.2064等碎片離子，它們分別為代謝產物M4脫去一分子水；脫去一個羰基及兩個羥基。

2.3 參與厚樸酚與和厚樸酚I期代謝的CYP450亞型酶

確定藥物的代謝途徑對了解藥-藥相互作用是至關重要的。大量結果表明抑制CYP450亞型酶的活性會減少代謝物的形成，CYP450的特異性抑制劑被確定為檢測CYP450代謝途徑的有力工具。因此，在RLMs反應系統中分別進行CYP2C，2A6，2D6，2E1，3A4，1A2和2B6亞型酶介導的化學抑制測定。在存在或不存在CYP450亞型酶特異性抑制劑的情況下，將底物加入RLMs中預孵育30 min。將對照組(無抑制劑)產物的峰面積定義為100%活性，并與用抑制劑處理的樣品進行比較。在CYP450特異性抑制劑的作用下，觀察代謝物的產量降低，表明該CYP450亞型酶催化該產物的產生。

圖4 CYP450亞型酶的特異性抑制劑對CYP450中厚樸酚代謝物產生率的影響Fig.4 Effects of specific inhibitors of CYP450 subtypes enzymes on the metabolite production rates of Magnolol in CYP450 Blank control without inhibitor.All values are the mean±SEM of three determinations(n=3).Bar graph from left to right:

厚樸酚在大鼠肝微粒體中有5種主要代謝物，對其進行代謝途徑的探究。通過特異性抑制劑對CYP450代謝物產率的影響(圖4)可以看出，CYP2C抑制劑僅抑制M1產物的形成；CYP2A6抑制劑僅抑制M2產物的形成；CYP2E1抑制劑抑制M1、M2和M3產物的形成；CYP3A4抑制劑僅抑制M1、M2和M5產物的形成；CYP1A2抑制劑抑制M1、M4和M5產物的形成；CYP2B6抑制劑僅抑制M1、M2、M4和M5產物的形成。而CYP1A2和CYP2E1抑制劑顯著抑制M1和M3的產物形成。并且，CYP2D6抑制劑對厚樸酚的5種產物均無抑制作用，這說明CYP2D6亞型酶可能對厚樸酚的代謝沒有指導作用。由CYP450亞型酶指導的厚樸酚代謝產物的結構及其代謝途徑顯示于圖5中。CYP1A2和2C是厚樸酚氧化的主要代謝酶，CYP2E1是厚樸酚末端羥基化的主要代謝酶。

同理，對和厚樸酚的四種主要代謝產物進行探究，圖6表明：CYP2C抑制劑抑制M1、M2和M3產物的形成；CYP2A6和2D6抑制劑僅抑制M2的形成；CYP2E1抑制劑抑制所有產物的形成；CYP3A4抑制劑僅抑制M2、M3和M4產物的形成；CYP1A2抑制劑抑制M2、M3和M4產物的形成；CYP2B6抑制劑抑制所有產物的形成。結果說明：CYP2C可能是主導和厚樸酚氧化代謝的主要亞型酶，CYP1A2和2E1可能是負責將和厚樸酚轉化為羥基化和氫化代謝產物的主要亞型酶，CYP2B6亞型酶可能是指導和厚樸酚苯環羥基化代謝的主要亞型酶。由CYP450亞型酶指導的和厚樸酚代謝產物的結構及其代謝途徑如圖7所示。

圖6 CYP450亞型酶的特異性抑制劑對CYP450中和厚樸酚產率的影響Fig.6 Effect of specific inhibitors of CYP450 subtypes enzymes on the production rates of Honokiol in CYP450 Blank control without inhibitor.All values are the mean±SEM of three determinations(n=3).Bar graph from left to right:

圖7 和厚樸酚在大鼠肝微粒體中可能的代謝途徑Fig.7 Possible pathways of Honokiol in rat liver microsomes

2.4 統計分析

CYP450亞型酶的特異性抑制劑對厚樸酚、和厚樸酚在大鼠肝微粒體中產物產率的影響，用統計學軟件Origin 8.0進行統計，顯著的統計學差異(P<0.05)用*標記，所有值均為3次測定的平均值±SEM(n=3)。

3 結論

本文基于大鼠肝微粒體(RLMs)的體外代謝研究，將細胞色素P450(CYP450)特異性抑制劑與超高效液相色譜-高分辨質譜技術結合，開發了一種高分辨率、快速準確的檢測方法，系統地對厚樸酚、和厚樸酚在RLMs中的體外代謝情況及代謝產物進行探究。雖然對于CYP450亞型酶針對不同羥基化和氧化位點的通用指導性還未能確定，這或許在以后的研究中可以進一步深入探究，但該實驗仍然為進一步研究藥物相互作用提供了重要的參考。