微生態(tài)制劑與酶制劑聯(lián)合使用對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能、血液指標(biāo)和腸黏膜防御屏障相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

■余 婕程 蕾 陶弼菲 周 櫻胡修忠向 敏夏 瑜王定發(fā)*

（1.武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，湖北武漢430208；2.武漢新華揚(yáng)生物股份有限公司，湖北武漢430000）

斷奶是養(yǎng)豬生產(chǎn)中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。對(duì)仔豬實(shí)施早期斷奶措施不僅能夠提高母豬年生產(chǎn)力和分娩舍的利用率，也能夠降低仔豬的生產(chǎn)成本[1]。然而，由于在此過程中，仔豬經(jīng)受了環(huán)境、日糧、心理等方面的應(yīng)激，極易導(dǎo)致其采食量下降、增重緩慢和腹瀉等斷奶應(yīng)激綜合征現(xiàn)象[2]。抗生素作為一種抗病、促生長(zhǎng)的飼料添加劑被廣泛添加于仔豬日糧中，但是由于抗生素的大量和長(zhǎng)期使用，由此而產(chǎn)生的藥物殘留以及細(xì)菌耐藥性問題日益突出，尋找抗生素替代品成為了必然選擇。微生態(tài)制劑是一類用于調(diào)節(jié)宿主腸道微生態(tài)平衡，提高宿主健康水平的活菌制劑及其代謝產(chǎn)物。有研究指出，微生態(tài)制劑能夠增強(qiáng)機(jī)體免疫力，提高飼料轉(zhuǎn)化率，改善動(dòng)物腸道菌群結(jié)構(gòu)和生產(chǎn)性能，具有安全、無(wú)殘留、無(wú)耐藥性和無(wú)毒副作用等優(yōu)點(diǎn)，是理想的抗生素替代品之一[3-4]。飼用酶制劑同樣也作為一種飼料添加劑被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物日糧中，主要包括植酸酶、蛋白酶、脂肪酶、非淀粉多糖酶等，可用于提高飼料利用率，改善動(dòng)物生產(chǎn)性能，并可節(jié)約飼料資源，也可減少畜禽排泄物中氮、磷等物質(zhì)的含量，有助于減輕環(huán)境污染問題[5]。早期斷奶階段的仔豬胃腸道發(fā)育不完全，消化酶分泌量不足，日糧的突然改變?nèi)菀滓鹉c道損傷，因此需要外源性添加酶制劑以補(bǔ)充自身消化酶分泌量的不足[6-7]。近年來(lái)關(guān)于微生態(tài)制劑與酶制劑單獨(dú)添加于畜禽日糧中的研究較多，但對(duì)于其聯(lián)合使用的研究報(bào)道相對(duì)較少。本試驗(yàn)通過向斷奶仔豬日糧中同時(shí)添加酶制劑和多種益生菌，研究對(duì)其生產(chǎn)性能、血液指標(biāo)和腸道防御屏障功能的影響，為復(fù)合微生態(tài)制在仔豬生產(chǎn)中的推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

由酶制劑和多種益生菌組成的復(fù)合微生態(tài)制劑由武漢新華揚(yáng)生物技術(shù)有限公司提供，含木聚糖酶、β-甘露聚糖酶、淀粉酶、蛋白酶、屎腸球菌、丁酸梭菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌等。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼養(yǎng)管理

采用單因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選取體重相近[（7.39±0.12）kg]、健康狀況良好的“長(zhǎng)×大”24日齡斷奶仔豬180頭，隨機(jī)分為2組（每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30頭豬）。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗(yàn)組在基礎(chǔ)日糧中添加100 g/t的酶制劑+微生態(tài)制劑。試驗(yàn)基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。本試驗(yàn)在武漢市金龍畜禽有限公司仙人橋豬場(chǎng)進(jìn)行，試驗(yàn)期25 d，整個(gè)試驗(yàn)期間采用自由采食和飲水，保持豬舍的清潔，并及時(shí)消毒。

1.3 樣品采集與處理

在試驗(yàn)第26 d早上7：00對(duì)仔豬空腹稱重后，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選擇3頭豬前腔靜脈采血，并分離血清，置于-20℃保存待測(cè)。每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選擇1頭豬進(jìn)行屠宰，分離腸道，于空腸1/2處取10 cm左右腸段，用預(yù)冷的生理鹽水將腸道內(nèi)容物沖洗干凈，縱向剪開腸段，迅速用吸水紙吸干表面水分以及其他雜質(zhì)，用載玻片沿同一方向輕輕刮取空腸黏膜置于凍存管中，將凍存管迅速置于液氮中速凍，保存于-80℃冰箱待測(cè)。

1.4 測(cè)定指標(biāo)

1.4.1 生長(zhǎng)性能

分別于試驗(yàn)第1、26 d時(shí)以重復(fù)為單位對(duì)試驗(yàn)豬進(jìn)行空腹稱重，并在試驗(yàn)期間記錄飼料消耗量，計(jì)算平均日增重（ADG）、平均日采食量（ADFI），以及料重比（F/G）。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平

1.4.2 血清生化指標(biāo)

采用南京建成生物工程研究所生化試劑盒測(cè)定血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、總抗氧化能力（T-AOC）、丙二醛（MDA）的含量、總超氧化物歧化酶（T-SOD）活力以及谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活力，測(cè)定方法按說明書進(jìn)行。

1.4.3 血清免疫球蛋白及細(xì)胞因子含量

采用南京建成生物工程研究所ELISA試劑盒測(cè)定血清中免疫球蛋白（IgG）、白介素2（IL-2）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）含量，具體操作參見說明書。

1.4.4 空腸黏膜分泌型免疫球蛋白含量

稱取適量空腸黏膜凍存樣品，與預(yù)冷的生理鹽水按1∶9（w/v）進(jìn)行研磨勻漿，然后將研磨液3 000 r/min離心10 min，取上清液，放4℃冰箱待測(cè)。用南京建成生物工程研究所的ELISA試劑盒測(cè)定分泌型免疫球蛋白（Secretory Immunoglobulin A,sIgA）含量，具體步驟參見說明書。

1.5 組織中總蛋白的提取

取少量的組織置于2 ml EP管中，加入清洗干凈的鋼珠，每管加入300 μl組織裂解液（含PMSF），置于自動(dòng)勻漿機(jī)中勻漿。勻漿完成后將EP管置于冰上充分裂解30 min。裂解完成后，用移液器將裂解液轉(zhuǎn)移至1.5 ml離心管中，然后4℃ 12 000 r/min離心5 min，吸取上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度后分裝于1.5 ml離心管中，置于-80℃冰箱待測(cè)。

1.6 Western Blot

制備濃縮膠和分離膠，加樣后100 V電泳分離，然后電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，封閉后加入兔多抗閉鎖小帶蛋白1（Zonula occludens protein 1，ZO-1）和閉合蛋白（Occludin）的一抗（購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司），4℃過夜，二抗室溫孵育1 h，底物顯色用Thermo ECL試劑盒，具體操作按照說明書進(jìn)行。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行分析，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果

2.1 微生態(tài)制劑與酶制劑聯(lián)合使用對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能的影響（見表2）

由表2可見，與對(duì)照組相比，斷奶仔豬日糧中添加酶制劑和微生態(tài)制劑有提高其平均日增重和平均日采食量，降低料重比的趨勢(shì)（P＞0.05）。

2.2 微生態(tài)制劑與酶制劑聯(lián)合使用對(duì)斷奶仔豬血清生化指標(biāo)的影響（見表3）

由表3可見，與對(duì)照組相比，日糧中添加酶制劑和微生態(tài)制劑顯著降低了斷奶仔豬血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶活性（P＜0.05）；對(duì)堿性磷酸酶、總超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶活力，以及丙二醛含量均無(wú)顯著影響（P＞0.05）。

表3 微生態(tài)制劑與酶制劑聯(lián)合使用對(duì)斷奶仔豬血清生化指標(biāo)的影響

2.3 微生態(tài)制劑與酶制劑聯(lián)合使用對(duì)斷奶仔豬血清免疫球蛋白及細(xì)胞因子含量的影響（見表4）

由表4可見，與對(duì)照組相比，日糧中添加酶制劑和微生態(tài)制劑對(duì)斷奶仔豬血清IgG含量無(wú)顯著影響(P＞0.05)，顯著提高了IL-2和TNF-α的含量(P＜0.05)。

2.4 微生態(tài)制劑與酶制劑聯(lián)合使用對(duì)斷奶仔豬腸黏膜分泌型免疫球蛋白A含量的影響(見圖1)

由圖1可見，與對(duì)照組相比，日糧中添加酶制劑和微生態(tài)制劑顯著提高了斷奶仔豬空腸黏膜中sIgA的含量（P＜0.05）。

表4 微生態(tài)制劑與酶制劑聯(lián)合使用對(duì)斷奶仔豬血清免疫球蛋白及細(xì)胞因子含量的影響

圖1 微生態(tài)制劑與酶制劑聯(lián)合使用對(duì)斷奶仔豬空腸黏膜sIgA含量的影響

2.5 微生態(tài)制劑與酶制劑聯(lián)合使用對(duì)斷奶仔豬腸道緊密連接蛋白表達(dá)的影響（見圖2）

由圖2可見，與對(duì)照組相比，日糧中添加酶制劑和微生態(tài)制劑顯著提高了斷奶仔豬空腸黏膜中緊密連接蛋白 ZO-1（P＜0.05）和 Occludin（P＜0.01）的表達(dá)量。

3 討論

仔豬斷奶后產(chǎn)生的應(yīng)激往往導(dǎo)致生產(chǎn)性能的降低和消化系統(tǒng)功能紊亂[8]。本試驗(yàn)所用復(fù)合微生態(tài)制劑由酶制劑和多種益生菌組成，可為仔豬提供有機(jī)酸、消化酶類等對(duì)腸道健康有益的物質(zhì)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，通過向斷奶仔豬飼糧中添加酶制劑和微生態(tài)制劑，其平均日增重提高了2.65%，料重比降低了1.85%（P＞0.05）。這與梁恒之等[9]的研究結(jié)果類似，該研究小組向仔豬飼糧中添加250 g/t的合生元，主要成分為低聚木糖、低聚殼聚糖、枯草芽孢桿菌、丁酸梭菌等，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)其平均日增重和料重比均無(wú)顯著影響。然而，也有一些研究報(bào)道與本試驗(yàn)結(jié)果不盡相同。李瑞等[10]通過向生長(zhǎng)豬日糧中添加2 000 g/t的微生態(tài)制劑，主要成分為主要含乳酸桿菌、芽孢桿菌和酵母菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)顯著提高了平均日增重，但對(duì)料肉比無(wú)顯著影響。李雪莉等[11]向斷奶仔豬日糧中添加200 g/t以植物乳桿菌為主的復(fù)合微生態(tài)制劑，結(jié)果表明可顯著提高其平均日增重和采食量，并顯著降低料重比。導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果不盡相同的原因可能是復(fù)合微生態(tài)制劑的組成或在日糧中的添加劑量不同，本試驗(yàn)中復(fù)合微生態(tài)制劑的添加量相對(duì)較低。

圖2 微生態(tài)制劑與酶制劑聯(lián)合使用對(duì)斷奶仔豬空腸緊密連接蛋白表達(dá)的影響

對(duì)血清生化指標(biāo)的測(cè)定可在一定程度上反映機(jī)體的健康狀態(tài)。ALT和AST主要存在于肝臟和心臟的組織細(xì)胞中，正常情況下在血清中活性較低，當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)應(yīng)激情況時(shí)，血清中的轉(zhuǎn)氨酶活性升高。ALP是與機(jī)體消化代謝相關(guān)的酶，其活性高低可反映動(dòng)物的生長(zhǎng)狀況[12]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，斷奶仔豬日糧中添加酶制劑和微生態(tài)制劑顯著降低了血清中ALT和AST活性，對(duì)ALP活性無(wú)顯著影響，表明添加該復(fù)合微生態(tài)制劑具有一定改善肝臟功能的作用，有利于肝臟的健康發(fā)育。楊紅萍等[13]向斷奶仔豬日糧中添加2 000 g/t由乳酸菌、芽孢桿菌、雙歧桿菌按2∶1∶1組成的復(fù)合微生態(tài)制劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)可降低AST和ALP活性，與本試驗(yàn)結(jié)果類似。GSH-Px和SOD是生物體內(nèi)廣泛存在的重要抗氧化酶，MDA的含量則是反映生物膜脂質(zhì)過氧化水平和對(duì)生物膜損傷程度的指標(biāo)，因此測(cè)定T-SOD和GSH-Px活力以及MDA的含量可以反映機(jī)體清除氧自由基的能力和脂質(zhì)過氧化損傷的程度。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，添加100 g/t的酶制劑和微生態(tài)制劑對(duì)斷奶仔豬血清T-SOD和GSH-Px活力以及MDA的含量無(wú)顯著影響。梁恒之等[9]向仔豬飼糧中添加250 g/t的合生元，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)其血清T-SOD活力和T-AOC無(wú)顯著影響，與本試驗(yàn)結(jié)果有一定相似之處。

體液免疫是機(jī)體防御疾病的重要途徑，免疫球蛋白IgG是血清中主要的抗體成分，檢測(cè)其含量可反映機(jī)體體液免疫功能。細(xì)胞因子具有調(diào)控機(jī)體免疫應(yīng)答、及損傷組織修復(fù)等多種功能。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，添加100 g/t的酶制劑和微生態(tài)制劑對(duì)斷奶仔豬血清IgG含量無(wú)顯著響，但顯著提高了IL-2和TNF-α的含量。張建梅等[14]向斷奶仔豬日糧中添加2‰的復(fù)合微生態(tài)制劑，發(fā)現(xiàn)對(duì)血清IgG含量無(wú)顯著響。李瑞等[10]也發(fā)現(xiàn)有類似的試驗(yàn)結(jié)果。

sIgA在腸黏膜免疫中發(fā)揮重要作用，可抑制病原微生物在腸黏膜上的附植，是機(jī)體腸道黏膜免疫的第一道屏障[15]。研究表明，益生菌可通過刺激sIgA的產(chǎn)生增強(qiáng)黏膜屏障功能[16]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，向斷奶仔豬飼糧中添加100 g/t的酶制劑和微生態(tài)制劑可顯著提高空腸黏膜中sIgA的含量。秦紅等[17]向育肥豬日糧中添加100 g/t的芽孢桿菌制劑，發(fā)現(xiàn)顯著提高了空腸和回腸中sIgA的含量。肖宏德[18]向斷奶仔豬日糧中添加100 g/t枯草芽孢桿菌和300 g/t屎腸球菌，發(fā)現(xiàn)可顯著提高十二指腸中sIgA含量。上述研究報(bào)道均與本試驗(yàn)結(jié)果類似，表明本試驗(yàn)所用復(fù)合微生態(tài)制劑具有一定增強(qiáng)腸黏膜免疫功能的作用。

腸道緊密連接是腸黏膜上皮細(xì)胞間的一種重要的連接方式，構(gòu)成了腸道重要的機(jī)械屏障，對(duì)于抵御病原微生物通過腸黏膜進(jìn)入機(jī)體內(nèi)部組織具有重要作用，Occludin和ZO-1均是重要的緊密連接蛋白[19]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，向斷奶仔豬飼糧中添加酶制劑和微生態(tài)制劑可顯著提高空腸黏膜中ZO-1和Occludin蛋白的表達(dá)量。李雪莉等[20]研究發(fā)現(xiàn)，向斷奶仔豬日糧中添加植物乳桿菌可顯著上調(diào)空腸和回腸中Occludin和ZO-1 mRNA水平。龐敏等[21]向斷奶仔豬日糧中添加500 g/t的酪酸梭菌發(fā)現(xiàn)可顯著上調(diào)回腸和結(jié)腸中Occludin mRNA表達(dá)量，但對(duì)ZO-1 mRNA水平無(wú)顯著影響。上述研究報(bào)道與本試驗(yàn)結(jié)果基本類似，本試驗(yàn)將酶制劑與微生態(tài)制劑聯(lián)合使用添加于斷奶仔豬日糧中，其中的益生菌可能通過產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物影響腸道黏膜緊密連接蛋白表達(dá)。

4 結(jié)論

在斷奶仔豬日糧中添加微生態(tài)制劑和酶制劑，有提高平均日增重，降低料重比的趨勢(shì)；可顯著降低血液中ALT和AST活性，具有促進(jìn)肝臟健康的作用；對(duì)機(jī)體的抗氧化能力無(wú)顯著影響；顯著提高了空腸黏膜sIgA和緊密連接蛋白ZO-1和Occludin的表達(dá)量，提示具有一定增強(qiáng)腸黏膜防御屏障功能的作用。