香坊腸桿菌發酵果酒的香氣物質分析

劉小燕 周紅麗

(1. 湖南農業大學食品科技學院，湖南 長沙 410218；2. 食品科學與生物技術湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410218)

果酒是指以新鮮的水果或果汁為原料，經發酵而成的酒精度較低的發酵酒[1]，具有水果的風味和多種營養成分[2]。一般果酒的酒精含量在5%～10%，稍微高的酒精含量在14%左右[1，3]。水果的種類繁多，所以果酒風格各異。

發酵菌種的選育對果酒品質至關重要，中國果酒企業大都選擇純釀酒酵母，目前市場上果酒類發酵菌種主要以一些葡萄酒專用菌種和蘋果酒專用菌種為主，其他品種的果酒發酵專用菌種尚未形成[3]。純釀酒酵母生產的果酒雖然具有一定的果酒風味，但沒有鮮明的個性特點。

本課題組從不同種類刺葡萄表皮上分離到一株高產乙醇的香坊腸桿菌，該菌能耐高酒精度，且香味獨特濃郁。Chun[4]、徐賽男[5]、陳夢娟[6]和Jones[7]分別從黑龍江傳統酸面團、浙東腌冬瓜、刺葡萄表皮和甘蔗渣中分離出香坊腸桿菌并對其生理生化特性進行了研究，但其發酵產生的香氣成分尚未進行研究報道。本試驗擬分別以蘋果和梨子為原料制作發酵果酒，對其發酵過程進行跟蹤檢測，利用頂空固相微萃取—氣相色譜—質譜聯用技術分析(SPME-GC-MS)檢測其香氣成分，對比香坊腸桿菌發酵和安琪酵母菌發酵果酒產生的香氣物質的異同，旨在探明其香氣成分的種類和含量，為其能應用于果酒釀造提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮蘋果和梨子：購自東之源超市；

香坊腸桿菌：實驗室分離保藏；

酵母菌：安琪酵母有限公司；

偏重亞硫酸鈉：分析純，天津市化學試劑研究所；

葡萄糖：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

果膠酶：酶活≥500 U/mg，上海瑞永生物科技有限公司；

氯化鈉：分析純，天津市光復科技發展有限公司。

1.2 儀器與設備

磁力攪拌器：90型，上海滬西分析儀器廠有限公司；

氣相色譜—質譜聯用儀：GCMS-QP 2010型，島津企業管理(中國)有限公司；

高壓滅菌鍋：LMQC型，山東新華醫療器械股份有限公司；

恒溫培養箱：ZQPL-200型，天津市萊玻特瑞儀器設備有限公司。

1.3 試驗方案

1.3.1 香坊腸桿菌發酵過程中香氣成分跟蹤檢測 分別以蘋果和梨子為原料接種香坊腸桿菌發酵果酒，前發酵第3,7天分別取樣進行SPME-GC-MS分析，后發酵每隔7 d分別取樣進行SPME-GC-MS分析，分析香氣成分變化。

果酒發酵：新鮮成熟的蘋果和梨子分別洗凈去皮去核切塊，按0.02%(質量比)加入偏重亞硫酸鈉進行硫處理、壓榨，按0.1%(質量比)加入果膠酶處理2 h，調整糖度至24 °Bx，按3%(體積比)接種量接種活化好的香坊腸桿菌于28 ℃恒溫發酵，7 d后過濾繼續發酵至28 d。

1.3.2 香坊腸桿菌與安琪酵母發酵產生的的香氣物質對比

分別以蘋果和梨子為原料接種3%(體積比)活化好的香坊腸桿菌發酵果酒，同時按3%(體積比)接種活化好的安琪酵母菌發酵進行對照。第28天取樣進行SPME-GC-MS分析，分析對比其香氣物質。

1.4 分析方法

香氣物質采用SPME-GC-MS進行分析。

固相微萃取條件：移取1 mL去離子水和1 mL樣品于固相微萃取瓶中，加0.2 g氯化鈉，在45 ℃下平衡15 min，在45 ℃、磁力攪拌下萃取20 min，進行氣質分析，解析5 min。

氣相色譜條件：色譜柱：RTX-5MS；載氣：He；柱流量：1 mL/min，分流比30∶1，進樣口溫度：250 ℃；升溫程序：40 ℃保持2 min；以2 ℃/min升溫至80 ℃，保持2 min；以5 ℃/min升溫至250 ℃，保持2 min。

質譜分析條件：離子源：電子轟擊電離離子源(EI源)，檢測器電壓：1 500 V；離子源溫度：230 ℃，GC/MS連接域溫度：280 ℃；質量掃描范圍：0～1 000m/z。

結果比對分析：化合物結果通過NIST 11s.lib標準質譜圖庫進行比對[8-11]。

2 結果分析

2.1 香坊腸桿菌發酵過程中香氣成分跟蹤檢測

2.1.1 蘋果酒發酵過程中香氣物質跟蹤檢測 由表1、2可知，香坊腸桿菌發酵蘋果酒檢測出的香氣物質種類主要有醇類和酯類，分別占11.68%～45.77% 和40%～56%；其次為酸類、醛類、烷烴類和苯酚。含量較高的組分為3-甲基-1-丁醇、2-甲基丁醇、苯乙醇及乙酸苯乙酯、3-甲基丁基乙酸酯、2-甲基丁基乙酸酯、癸酸乙酯、辛酸乙酯、異丁酸等。在發酵第14天開始檢測出較高含量的庚醛，占12%，并隨時間穩定上升；在發酵第28天檢測出2,4,5-三甲基-1,3-二氧戊環，含量占10.88%。

研究發現：主要香氣成分中苯乙醇具有清甜的玫瑰樣花香[11]，乙酸苯乙酯有甜蜜的香味[12]；苯乙醇及其酯類和低級脂肪酸構成蘋果酒香氣的基本骨架，脂肪酸酯特別是2-甲基丁基乙酸酯賦予蘋果酒的蘋果香[13]；癸酸乙酯具有椰子香、葡萄酒香[14]，李記明等[15]研究認為其能反映蘋果酒中微弱的水果香、脂肪香、刺激、苦澀等香氣特征；辛酸乙酯具有白蘭地酒香[16]；庚醛在肉制品中呈現不良風味[17]，在茶葉中呈現青草氣[18]，但嵇海峰等[19]研究認為庚醛香氣活性值低，即便含量顯著增加也不會對產品風味造成較大影響。這些成分共同賦予果酒酒香、果香、花香、甜香、青草氣等香氣特征。

隨著發酵時間的延長，香氣物質整體更加豐富，醇類百分含量急速下降，從發酵第3天的45.77%降到發酵第28天的11.687%；酯類種類整體增加，百分含量先升后降。

2.1.2 梨子酒發酵過程中香氣物質跟蹤檢測 由表3、4可知：香坊腸桿菌發酵梨子酒檢測出的香氣物質種類主要有醇類和酯類，分別占15%～55%和35%～46.56%；其次為酸類、醛類、烷烴類、苯酚和極少量的酮。含量較高的組分為3-甲基-1-丁醇、2-甲基丁醇及乙酸苯乙酯、3-甲基丁基乙酸酯、2-甲基丁基乙酸酯、癸酸乙酯、異丁酸等。在發酵第14天開始檢測出較高含量的庚醛，占11.76%，并隨時間穩定上升；在發酵第28天檢測出2,4,5-三甲基-1,3-二氧戊環，含量占8.52%。

隨著發酵時間的延長，香氣物質整體更加豐富，醇類的種類整體增加，但百分含量微升后急速下降，從發酵第7天的55.15%降到發酵第28天的15.87%；酯類種類整體增加，百分含量微下降，絕對含量變化有待進一步研究。

2.2 香坊腸桿菌和安琪酵母菌發酵果酒的香氣物質對比分析

2.2.1 發酵蘋果酒的香氣物質 由圖1，表5可知，分別接種香坊腸桿菌(試驗組)和安琪酵母菌(對照組)發酵蘋果酒檢測出的香氣物質中，有20種相同香氣物質，有9種從試驗組檢測出而對照組未檢測出，有18種從對照組檢測出而試驗組未檢測出。試驗組總醇11.69%，總酯40.39%；對照組總醇24.78%，總酯51.93%。

從香坊腸桿菌發酵的蘋果酒中檢測出的主要香氣物質有庚醛、2,4,5-三甲基-1,3-二氧戊環、癸酸乙酯、乙酸苯乙酯、乙縮醛、辛酸乙酯、異丁酸、3-甲基-1-丁醇、苯乙醇、2-甲基-2-乙基丙酸乙酯、3-甲基丁基乙酸酯等，這些香氣物質賦予蘋果酒酒香、花香、果香、甜香、青草氣等香氣特征。

表1 蘋果酒香氣物質隨時間的變化

表2 蘋果酒香氣物質分類匯總表

表3 梨子酒香氣物質隨時間的變化

表4 梨子酒香氣物質分類匯總表

從安琪酵母菌發酵的蘋果酒中檢測出的主要香氣物質有癸酸乙酯、苯乙醇、辛酸乙酯、2,4,5-三甲基-1,3-二氧戊環、3-甲基-1-丁醇、乙縮醛、十二酸乙酯等，這些香氣物質賦予蘋果酒酒香、花香、果香等香氣特征。

2.2.2 發酵梨子酒的香氣物質 由圖2，表6可知，分別接種香坊腸桿菌(試驗組)和安琪酵母菌(對照組)發酵梨子酒檢測出的香氣物質中，有24種相同香氣物質，有12種從試驗組檢測出而對照組未檢測出，有11種從對照組檢測出而試驗組未檢測出。試驗組總醇15.87%，總酯36.35%；對照組總醇23.29%，總酯51.26%。

從香坊腸桿菌發酵的梨子酒中檢測出的主要香氣物質有庚醛、乙酸苯乙酯、3-甲基-1-丁醇、2,4,5-三甲基-1,3-二氧戊環、異丁酸、乙縮醛、癸酸乙酯、苯乙醇、2-甲基-2-乙基丙酸乙酯、3-甲基丁基乙酸酯等，這些香氣物質賦予梨子酒酒香、花香、果香、甜香、青草氣等香氣特征。

圖1 蘋果酒發酵第28天香氣物質圖譜

Figure 1 TIC diagram of aroma substance on the 28 day of apple wine fermentation

從安琪酵母菌發酵的梨子酒中檢測出的主要香氣物質有癸酸乙酯、苯乙醇、辛酸乙酯、2,4,5-三甲基-1,3-二氧戊環、乙縮醛、十二酸乙酯、3-甲基-1-丁醇和己酸乙酯等，這些香氣物質賦予梨子酒酒香、花香、果香等香氣特征。

3 結論

香坊腸桿菌和安琪酵母發酵果酒有其相同的香氣物質，但在總體上香氣成分種類和含量都有很大的差異。二者既有相似的基本香氣構成，又有其獨特的香氣特點。癸酸乙酯、辛酸乙酯、苯乙醇等賦予二者酒香、果香和花香，其中安琪酵母菌發酵產生的癸酸乙酯、辛酸乙酯百分含量更高，果酒酒香更明顯；而香坊腸桿菌發酵產生的乙酸苯乙酯和庚醛賦予果酒甜香和青草氣。

圖2 梨子酒發酵第28天的香氣物質圖譜

Figure 2 TIC diagram of aroma substance on the 28 day of pear wine fermentation

表5香坊腸桿菌和安琪酵母菌發酵蘋果酒第28天的香氣物質對比

Table 5 Comparison of aroma components between enterobacter aeruginosa and angel yeast fermented apple wine on the 28 Day %

組分香坊腸桿菌安琪酵母2,4,5-三甲基-1,3-二氧戊環10.882 69.078 7乙縮醛7.275 76.314 43-甲基-1-丁醇5.323 18.634 2醋酸異丁酯1.727 80.239 3正己醇0.583 20.996 43-甲基丁基乙酸酯3.195 91.678 82-甲基丁基乙酸酯0.875 80.338 61-(1-乙氧基乙氧基)-戊烷0.259 53.121 5己酸乙酯0.462 42.144 0壬醛0.877 50.273 2苯乙醇5.302 813.945 0十六酸乙酯1.707 50.626 6辛酸乙酯6.235 312.390 8癸醛1.553 90.676 2乙酸苯乙酯7.510 10.738 49-癸烯酸乙酯0.532 41.676 4癸酸乙酯10.381 324.897 72,4-二(1,1-二甲基乙基)苯酚1.287 20.238 6十二酸乙酯1.443 65.100 9鄰苯二甲酸二乙酯1.064 10.166 22,3-二甲基己烷0.652 8甲基戊醇0.131 2二氫-2-甲基-3(2H)-噻吩酮0.477 32-乙基己醇0.222 3DL-2-羥基己酸乙酯0.166 3庚酸乙酯0.556 0樟腦0.626 4薄荷醇0.246 73,4,5-三甲基-4-庚醇0.604 1琥珀酸二乙酯0.352 0萘1.528 7苯乙酸乙酯0.233 5壬酸乙酯0.214 8辛酸3-甲基丁酯0.135 6香葉基丙酮0.176 8正十五烷0.129 3十五烷酸-3-甲基丁酯0.134 1十四酸乙酯0.135 9乙酸正丙酯0.586 3庚醛15.454 12-甲基-2-乙基丙酸乙酯4.666 7異丁酸5.923 32-甲基丁酸1.416 1奧苷菊環1.893 01-丁醇0.480 0十七烷0.456 48-甲基十七烷0.642 5

表6香坊腸桿菌和安琪酵母菌發酵梨子酒第28天的香氣物質對比

Table 6 Comparison of aroma components between enterobacter aeruginosa and angel yeast fermented pear wine on the 28 Day %

組分安琪酵母香坊腸桿菌2,4,5-三甲基-1,3-二氧戊環8.242 68.524 8乙縮醛5.095 35.893 93-甲基-1-丁醇4.140 98.790 9庚醛5.548 614.377 72-甲基-2-乙基丙酸乙酯0.753 03.641 7異丁酸1.172 26.681 1醋酸異丁酯0.284 92.478 73-甲基丁酸0.187 60.647 52-甲基丁酸0.185 22.119 43-甲基丁基乙酸酯1.196 73.631 92-甲基丁基乙酸酯0.298 21.246 1二氫-2-甲基-3(2H)-噻吩酮0.680 60.788 82-乙基己醇0.215 30.592 6壬醛0.531 21.415 4苯乙醇17.318 44.643 5奧苷菊環1.524 82.099 8辛酸乙酯14.064 82.008 4癸醛1.381 62.580 5乙酸苯乙酯1.139 610.312 4癸酸乙酯20.574 04.936 3十二酸乙酯4.726 90.864 5十四酸乙酯0.283 60.612 7十六酸乙酯1.903 52.956 2十八酸乙酯0.179 60.494 0正己醇0.306 01 -庚醇1.143 3己酸乙酯3.043 4芳樟醇0.170 8十三碳醛0.234 6琥珀酸二乙酯0.806 0反-4-癸烯酸乙酯1.144 0辛酸3-甲基丁酯0.292 0香葉基丙酮0.317 33,5-二叔丁基苯酚0.348 29-十六碳烯酸乙酯0.565 11-丁醇0.944 6丙酸乙酯0.256 2乙酸正丙酯1.194 62,4-二(1,1-二甲基乙基)苯酚2.085 5鄰苯二甲酸二乙酯0.637 2十七烷0.257 0鄰苯二甲酸二異丁酯0.359 2十五酸乙酯0.303 02-癸烯-1-醇0.411 2二十烷0.316 3油酸乙酯0.407 33-甲基-1-戊醇0.488 9

由于不同香氣物質閾值不同，各成分之間可能相互影響，香氣成分對果酒的影響與其含量并不呈正相關，所以不能單依據香氣成分含量評價香坊腸桿菌發酵果酒與安琪酵母發酵果酒的優劣。要解決此問題可結合感官品評評價香坊腸桿菌發酵果酒。