基于低場核磁共振技術的咸鴨蛋腌制過程水分及質構特性變化

龍 門 張文豪 鄭素玲 齊安琪 詹 歌

(1. 滁州學院生物與食品工程學院，安徽 滁州 239000；2. 滁州市食品加工研究院，安徽 滁州 239000)

咸鴨蛋是中國傳統蛋制品，其蛋黃沙糯的質地和咸香的風味深受消費者喜愛，除直接食用外，也被廣泛用于中國傳統食品——月餅、粽子等中[1]。質構特性和鹽含量是咸鴨蛋成熟的重要品質特性，目前研究主要集中在腌制工藝對其凝膠強度、持水性和鹽含量等指標的影響[2]；同時不同的腌制環境(溫度、濕度)對咸鴨蛋成熟期有顯著的影響，而凝膠強度、持水性和鹽含量等指標的測定都需要對咸蛋進行破壞性檢測，檢測周期長，且造成原料損耗。低場核磁共振技術( low-field nuclear magnetic resonance，LF-NMR)可通過測定水分子的弛豫特性T2、與食品組分的結合狀態判斷食品中自由水、結合水、不易流動水的遷移[3-4]，同時可獲得氫離子密度圖像，分析食品中不同水分的分布狀況[5-6]。目前，LF-NMR技術已被廣泛應用于肉制品、果蔬、面制品等食品領域。秦影等[7]在對大黃魚魚糜的研究中發現，水分狀態及含量與質構指標和保水率之間存在相關性，鹽離子對魚糜凝膠的強度、顯微結構和水分分布都有影響[8]；徐雷等[9]研究表明雞蛋的氣室高度、蛋黃指數等與弛豫參數之間存在相關性，可利用弛豫參數預測雞蛋的貨架期，也有學者[10]發現白煮蛋表觀品質的變化與蛋清和蛋黃中水分分布的變化相關。咸蛋在腌制過程中蛋清和蛋黃的質構特性可能受到鹽離子的影響，同時又與其水分狀態及含量變化相關。

目前關于結合LF-NMR技術研究腌制食品在加工過程中水分分布及品質變化規律的報道甚少?；诖?，本研究擬利用該技術深入分析咸鴨蛋在腌制過程中水分分布變化規律及品質的變化，以期應用低場核磁技術預測咸鴨蛋成熟度和品質，以拓展此技術在腌制類食品品質評價中的應用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氯化鈉、硝酸銀：分析純，天津科密歐化學試劑有限公司；

硝酸、乙醇、硫酸鐵銨、硫氰酸鉀、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

冰乙酸：分析純，天津市津東天正精細化學試廠；

食鹽：食品級，市售；

新鮮鴨蛋：滁州市白云超市。

1.2 儀器與設備

物性測試儀：TA-XTplus型，英國Stasle Micro System公司；

恒溫加熱磁力攪拌器：Cy-2型，鞏義市予華儀器有限責任公司；

快速水分測定儀：M2-08型，杭州科博儀器有限公司；

電子天平：JA5003J型，上海越平科學儀器有限公司；

電子分析天平：FA2204B型，上海越平科學儀器有限公司；

低場核磁：MeSONMRI3-060V-I型，蘇州(上海)紐邁電子科技有限公司；

料理機：C010-7067型，九陽股份有限公司；

多功能電磁爐：C21-ST2125型，廣東美的生活電器制造有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 咸鴨蛋腌制工藝 按質量比為5∶4將洗凈晾干的鴨蛋放入20%的食鹽腌制液中，最上層壓以適量重物以保證所有鴨蛋都浸沒在腌制液中，在(20±5) ℃下進行腌制，每隔3 d翻動原料蛋1次。每隔5 d隨機選取一定數量的咸鴨蛋，將咸鴨蛋用溫開水洗凈后，放于沸水的蒸籠上蒸20 min，測定各項理化指標。

1.3.2 水分測定 按GB 5009.3—2016的直接干燥法執行。

1.3.3 NaCl測定 按GB 5009.44—2016的間接沉淀滴定法執行。

1.3.4 低場核磁共振分析方法 根據Aursand等[11]的方法略作修改：分別取一定質量(m)的蛋清凝膠或蛋黃凝膠放入直徑60 mm的玻璃試管中，將樣品管置于NMR探頭中(保持溫度32 ℃)，使用CPMG序列測試橫向弛豫時間T2，測試條件：接收機帶寬100 kHz，采樣起始點控制參數0.200 ms，重復采樣時間間隔2 500.000 ms，模擬增益 10.0 db，90°和 180°脈寬分別為16， 31 μs，采樣點數469 804，數字增益2，數據半徑1，累加掃描次數8，回波個數18 000。試驗取4份平行，每份平行測3次。然后對其進行反演，得到T2譜圖，對峰面積進行累計積分，得到峰面積A。

1.3.5 低場核磁成像分析方法 根據劉斯琪[12]的方法略微修改：將咸鴨蛋洗凈后置于NMR探頭中(保持溫度32 ℃)，采用多層自旋回波序列(Multi-Slice Echo，MSE)進行質子加權成像，Y軸為選層梯度，X軸為相位梯度，Z軸為讀出梯度，90°和 180°軟脈沖均為20.000 ms，重復采樣時間為500.000 ms，半回波時間為20.000 ms，選層梯度脈沖(90°)對應的補償梯度為1.4%，選層梯度脈沖(180°)對應的補償梯度脈沖為6.6%。

1.3.6 質構分析方法 將冷卻到室溫的蛋清或者蛋黃切成近似20 mm×20 mm×20 mm的正方體，采用物性測試儀測定其質構參數。使用型號為P/36R探頭對樣品進行連續兩次50%的擠壓。測定條件：測前速度1 mm/s；測試速度4 mm/s；測后速度4 mm/s；壓縮程度50%；停留時間5 s；數據采集速率400 pps；觸發值0.196 N。

1.3.7 持水力測定 參考Kocher等[13]的方法并略有修改，取3 g冷卻到室溫蛋清凝膠樣品加入離心管中，12 000 r/min 離心15 min，去除離心出的水分，稱量凝膠質量。按式(1)計算持水性：

WCH=(m1-m0)÷(m2-m0)×100%，

(1)

式中：

WCH——凝膠持水力，%；

m1——離心后凝膠質量，g；

m0——離心管質量，g；

m2——離心前凝膠質量，g。

1.4 數據統計處理

所有數據利用Microsoft Excel進行統計處理，采用Origin 9.0進行作圖分析。不同平均值之間用SAS 8.2(SAS Institute Inc, Cary, North Carolina, USA)統計軟件的GLM程序(General Linear Model procedure)中的鄧肯氏多重比較法(Duncan' s Multiple Range Test)進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 咸鴨蛋腌制過程中鹽分和水分的變化

由圖1可知，腌制過程中，蛋清與蛋黃中水分含量顯著降低(P<0.05)，而鹽分含量顯著上升(P<0.05)，在腌制后期變化逐漸趨于平緩。腌制過程中，水分和鹽離子從蛋殼上的空隙遷出和遷入，蛋黃中水分的降低程度大于蛋清，而鹽分含量的升高程度小于蛋清，可能是由于：① 蛋清和蛋黃中水分含量的差異導致滲透壓不同，物質遷移的速率不同； ② 物質遷移過程中遇到的阻力不同，對遷移速率的影響不同，蛋黃的密度相比于蛋清更高，內部的脂肪等物質對鹽分的阻滯力度更大[14-15]；③ 蛋清和蛋黃中不同的蛋白質種類，與水分的結合程度不同，也會對水分的遷移有所影響[16-17]。

圖1 不同腌制時期咸鴨蛋蛋黃、蛋白水分和鹽分變化Figure 1 Moisture and salt content of albumin and yolk gel during salting period

2.2 腌制過程中蛋清和蛋黃水分分布及遷移的變化

蛋清凝膠的反演圖譜中共有3個峰，分別為T21(0.1～10.0 ms)、T22(10～100 ms)和T23(100～1 000 ms)，而蛋黃的反演圖譜有4個峰，各自是T21(0.1～2.0 ms)、T22a(8～30 ms)、T22b(40～150 ms)和T23(150～500 ms)；蛋清和蛋黃中弛豫時間為T21的為結合水，T22、T22a和T22b的為不易流動水，T23的為自由水。T2弛豫曲線的積分面積正比于氫質子的含量，即水分含量，而不同積分面積占總積分面積的百分比可表示不同狀態水占總水分的相對比例[18-21]。

如圖2(a)所示，腌制過程中，蛋清凝膠的弛豫曲線向右偏移，在腌制后期曲線的變化趨于穩定，表明蛋清凝膠中水分受到的束縛力減弱；圖3(a)反映了3種狀態水的相對比例變化情況，其中結合水和不易流動水的相對比例在下降，而自由水的相對比例在上升；蛋清凝膠對水分束縛力減弱的原因可能是凝膠結構中孔徑變大[22]，同時，蛋白質與水分的結合作用被削弱[23-24]。因為腌制過程中，滲入蛋清中帶電的鈉離子和氯離子，一方面會屏蔽蛋白質上的電荷，降低蛋白質間的斥力，蛋白質易于相互靠近[17,25]；另一方面會影響維持蛋白質結構的二硫鍵、氫鍵和疏水鍵等次級鍵，并使得蛋白質內部的疏水鍵暴露，在疏水相互作用和分子間二硫鍵作用下，靠近的蛋白質會相互聚集[24]；在熱誘導凝膠的形成過程中，蛋白質之間過早的靠近和聚集，更易于形成無規卷曲結構，造成凝膠結構中孔徑較大，凝膠對不易流動水分的束縛力降低，滯留的水分易于轉變為自由水[17]；同時，疏水鍵的暴露也會減弱蛋白質與水分的結合作用，而鹽離子會破壞蛋白質的親水基團與水分子之間的氫鍵等作用力， 結合水與凝膠結構的結合度降低，水分的自由度增加[23]。

由圖2(b)可知，腌制過程中蛋黃的弛豫曲線向左偏移，表明蛋黃中水分受到的束縛力增強，由圖3(b)可得結合水的相對含量增加，而自由水的相對含量前期增加后期降低。蛋黃中水分受到束縛力增強的原因可能是形成了脂蛋白—水—NaCl復合物，使得水分結合更加緊密[26]。

圖2 蛋清和蛋黃凝膠的水分弛豫時間T2Figure 2 Water relaxation time(T2) of egg white and yolk

圖3 蛋清和蛋黃凝膠中3種狀態水分的相對百分含量Figure 3 Relative content of three states of water in egg white and yolk

蛋黃由漿液和顆粒組成，隨著鹽離子的滲入，蛋黃顆粒中高密度脂蛋白(HDL)與卵黃高磷蛋白結合的磷酸鈣橋中的鈣離子被鈉離子取代，破壞了蛋黃的顆粒結構?？扇苄缘穆腰S高磷蛋白溶出到漿液中[12,27]，漿液中水分含量較高，在鹽離子和脫水作用下黏度增加，其中的蛋白質聚集體相互結合，破壞乳化體系，導致腌制前期部分不易流動水轉變為自由水，自由水的相對比例增加[12]，同時，在熱誘導作用下聚集的蛋白質與水，形成了脂蛋白—水—NaCl復合物，使得水分受到的束縛力增強[28]。

2.3 腌制過程咸鴨蛋核磁成像變化

圖4為咸鴨蛋低場核磁共振成像圖，亮度越高，氫質子的密度越高，水分含量越高[4,26]。由圖4可知，未腌制時，蛋清中整體較亮，水分分布較均勻，相比于內層濃厚蛋白，外層稀薄蛋白中水分含量更高；而蛋黃中的亮度較暗，其中外層亮度較高，表明外層漿液水分含量更高；隨著腌制時間的延長，蛋清中的亮度逐漸降低，亮區逐漸減少到只剩邊緣，表明整體水分不斷減少，而內層水分向外層遷移；蛋黃中的外層亮度不斷降低，外層水分逐漸向蛋清遷移，而內部脂質中氫質子的亮區逐漸集中而亮度不斷增加，表明在脫水和鹽離子作用下，蛋黃中的脂蛋白顆粒在內部聚集并結合地更加緊密，在腌制后期，蛋清和蛋黃中亮度的變化逐漸趨于穩定，水分的變化也趨于穩定。

圖4 咸鴨蛋低場核磁共振成像圖Figure 4 Magnetic resonance image of duck egg during salting period

2.4 蛋清和蛋黃質構特性變化

由表1可知，在腌制過程中，蛋清凝膠的硬度、彈性、內聚性和咀嚼性都在顯著降低(P<0.05)，后期逐漸穩定，而凝膠持水力前期顯著降低(P<0.05)，后期略有升高；硬度、彈性、內聚性、咀嚼性和凝膠持水力的顯著降低(P<0.05)，可能是蛋清凝膠中的孔徑增大和交聯度的降低[22-24]，而這可能與鹽離子和熱誘導作用有關，帶電的鹽離子會破壞蛋白質的次級鍵，影響蛋白質的極性基團與水分的結合，導致蛋白質的二級結構β-折疊的含量增加，α-螺旋和β-轉角的含量下降，同時，內部的疏水鍵暴露[19]，使相鄰蛋白質更易聚集，形成較高分子量的蛋白質單體[29-30]，在熱變性階段高分子量的單體不能完全展開，熱交聯過程中更易于形成隨機無序結構，導致形成的蛋清凝膠結構疏松，單體較大而分布不均勻，交聯度低空洞大[31]，且隨著鹽離子含量增高，凝膠結構可能越疏松，而孔徑可能越大，而后期凝膠持水力的增加可能與水分含量的顯著降低有關(P<0.05)[32]。

如表2所示，在腌制過程中，咸蛋黃的硬度、內聚性和咀嚼性都在顯著增加(P<0.05)，而彈性在降低，質構指標在后期逐漸穩定；硬度、內聚性和咀嚼性的增加，可能是鹽離子和熱誘導作用，使得蛋黃中成分的在疏水相互作用和二硫鍵等次級鍵的作用下結合的更加緊密[17,33]，其中，鹽離子導致蛋黃顆粒中的脂蛋白結構改變，可溶性蛋白質脫離，而脫水作用導致漿液的黏度增加,蛋白質等成分因此相互靠近并結合形成聚集體[12,17]；熱誘導作用導致水分子運動加劇，脂蛋白質聚集體因體積較大，發生變性后的疏水鍵和巰基暴露的也較多，在熱誘導凝膠形成過程中，數量較多的疏水鍵和巰基結合形成緊密的脂蛋白—水—NaCl復合物[26]，因此，硬度、內聚性和咀嚼性不斷增加。而彈性的降低可能與蛋黃中水分含量的降低和蛋黃硬度的增加有關[34]，而在腌制后期由于蛋白質聚集體的增大和結構緊密，焓變溫度增高，耐熱性增加，熱誘導對質構結構的影響程度降低，質構特性的變化趨于穩定[35]。

表1 蛋清質構特性變化?

? 同列不同字母代表樣品存在顯著差異(P<0.05)。

表2 蛋黃質構特性變化?

? 同列不同字母代表樣品存在顯著差異(P<0.05)。

2.5 各指標相關性分析

由表3可知，蛋清硬度、內聚性和咀嚼性與不易流動水(T22)和自由水(T23)存在顯著的相關性(P<0.05)[36]。蛋清凝膠中不易流動水截留在蛋清凝膠中，而自由水在凝膠孔徑中[21]，不易流動水和自由水與凝膠結合程度下降，凝膠三維網狀結構的交聯度降低及其孔徑變大，因此凝膠的強度下降，維持其網狀結構的能力和內部結合力變弱[23]；持水性與自由水的積分面積、弛豫時間T23和水分含量存在顯著的相關性(P<0.05)，自由水的流動性較大越容易失去，鹽離子對蛋清蛋白質結構的影響，導致凝膠中的自由水的相對含量增加，凝膠的持水性因此下降[34]，而后期由于水分含量的顯著降低(P<0.05)，凝膠的持水力也略有增加。

由表2可知，不易流動水(T22)和自由水(T23)的弛豫時間與蛋黃凝膠的硬度、內聚性和咀嚼性存在顯著相關性(P<0.05)；腌制過程中，結合水的結合越來越緊密，表明蛋黃中的脂蛋白—水—NaCl凝膠結構更加致密[29]，凝膠的強度，分子間結合力和咀嚼性也因此增加。彈性與水分含量存在顯著相關性(P<0.05)，說明蛋黃凝膠的水分含量的減少，能夠在一定范圍內解釋凝膠彈性的降低。

? *表示P<0.05 水平差異顯著；**表示P<0.01 水平差異顯著。

表4 蛋黃各指標間的相關性?

? *表示P<0.05 水平差異顯著；**表示P<0.01 水平差異顯著。

3 結論

本研究利用LF-NMR測定在腌制過程中咸鴨蛋水分分布狀態，并研究鹽離子對咸鴨蛋蛋清和蛋黃凝膠特性的影響，且發現凝膠持性與宏觀的質構和持水性等評價指標存在相關性。結果表明，利用LF-NMR技術對咸鴨蛋水分含量及狀態的測定可作為預測咸鴨蛋成熟度和品質的參考指標，縮短咸鴨蛋檢測周期，減少原料損耗，可為工業化生產咸鴨蛋降低成本提供幫助。