石榴皮多酚對膽固醇流出及相關蛋白表達的影響

趙勝娟 向進樂 陳樹興費 鵬 徐云鳳 李建科

(1. 陜西師范大學食品工程與營養科學學院，陜西 西安 710119；2. 河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023)

膽固醇代謝有著嚴格的調控機制，在正常情況下，細胞內的膽固醇代謝保持著動態平衡，該平衡一旦打破會導致機體病變，因此維持機體細胞內膽固醇的動態平衡至關重要[1-2]。當機體內皮細胞受到外界刺激發生損傷時，巨噬細胞對膽固醇的攝入不受細胞內膽固醇含量負反饋機制的調節，進而會打破巨噬細胞內膽固醇的平衡，在細胞內形成大量脂滴，直至巨噬細胞發生泡沫化，導致動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的發生，嚴重地危害人們的健康[3-4]。

石榴皮多酚(pomegranate peel polyphenols，PPPs)是石榴中重要的活性成分，具有抗氧化、抗癌、抗菌、降血脂等多種生物學功能[5]。研究[6-7]表明PPPs可以降低巨噬細胞膽固醇和氧化脂質的積累，以抑制泡沫細胞的形成，從而減少AS及心血管疾病的發生，然而，石榴多酚抑制泡沫細胞形成的機制尚不完全清楚。促進巨噬細胞膽固醇流出對減少細胞內脂滴形成、防止巨噬細胞泡沫化和AS發生具有重要意義，已經成為了研究減緩或防止AS發生的一個新靶點[8]。現有研究[9-11]表明，清道夫受體 B1(Scavenger receptor B1，SR-B1)、酰基輔酶A：膽固醇酰基轉移酶(acyl-coenzyme A1: cholesterol acyltransferase，ACAT1)和膽固醇酯水解酶(cholesteryl ester hydrolase，nCEH)與機體膽固醇的流出密切相關。SR-B1是重要的抗AS受體，參與膽固醇酯的逆轉運，能夠有效地促進膽固醇的流出[12]。ACAT1和nCEH是調節機體內膽固醇平衡代謝的關鍵蛋白[10]，能夠維持細胞中游離膽固醇(free cholesterol，FC)的濃度，促進膽固醇的流出。因此，分析PPPs對SR-B1、ACAT1和nCEH蛋白表達調控作用對解釋該物質促進膽固醇流出的作用機制至關重要。

本試驗擬以PPPs為研究對象，構建Raw264.7巨噬細胞源性泡沫細胞模型，探索PPPs對SR-B1及膽固醇平衡代謝關鍵蛋白酶(SR-B1、ACAT1和nCEH)表達的影響，分析在PPPs作用下ACAT1和nCEH酶活性的變化，為揭示PPPs促進膽固醇流出及抑制泡沫細胞形成的機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

PPPs：紫外檢測多酚含量為60%，主要成分為鞣花酸、沒食子酸和安石榴苷，在濃度為0～50 μg/mL時對巨噬細胞無毒性[13]，陜西天地源生物科技有限公司；

Raw264.7小鼠巨噬細胞：陜西師范大學食品營養與安全實驗室保存；

膽固醇測定試劑盒：北京普利來基因技術有限公司；

ox-LDL、高密度脂蛋白(High density lipoprotein，HDL)：廣州奕源生物公司；

DMEM無酚紅基礎培養基：美國Hyclone公司；

胎牛血清：Gibco 10099-141，美國Gibco| Life Technologies公司；

ACAT1(BS8471)：美國Bioworld Technology公司；

nCEH(ab111544)抗體、SR-B1抗體(ab52629)：英國Abcam公司；

ACAT1、nCEH的ELISA試劑盒：上海酶聯生物技術有限公司。

1.2 儀器

普通倒置顯微鏡：OLYMPUS CKX41型，日本OLYMPUS公司；

全波長酶標儀：Multiskan GO型，美國熱電公司；

生物柜：ESCO AC2-4S1型，新加坡 ESCO有限公司；

脫色搖床：WD-9405A型，北京六一儀器廠；

暗匣：AX-Ⅱ型，廣東粵華醫療器械廠有限公司；

電泳儀：DYY-6C型，北京六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 Raw264.7巨噬細胞源性泡沫細胞模型的建立

收集對數生長期的小鼠巨噬細胞Raw264.7，調整到適宜濃度，接種于12孔板，正常培養24 h后，更換無血清培養基繼續培養12 h，使細胞同步化，然后分為正常對照組，泡沫細胞模型組(Ox-LDL)組，正常對照組更換新鮮培養基，泡沫細胞組加入含60 μg/mL Ox-LDL的培養基。繼續培養24 h，棄培養基用PBS清洗2次，然后對細胞進行油紅O染色，測定其游離膽固醇和總膽固醇[14]。

1.3.2 石榴皮多酚對HDL介導的巨噬細胞膽固醇流出的影響 收集對數生長期的小鼠巨噬細胞Raw264.7，調整到適宜濃度，接種于96孔板，正常培養24 h后，細胞用PBS清洗2次，更換無血清培養基，并分成4組(對照和藥物處理組)，具體分組情況見表1，藥物組加入各濃度PPPs對細胞進行預處理，1 h后加入ox-LDL(終濃度為60 μg/mL)，再繼續培養24 h，之后更換含HDL(50 μg/mL)的無血清無酚紅培養基繼續培養，24 h后收集細胞液，4 ℃、10 000 r/min離心5 min，然后用膽固醇測定試劑盒測定上清膽固醇含量。

表1 細胞處理分組

1.3.3 Western blotting法檢測SR-B1、ACAT1和nCEH的蛋白表達 不同濃度PPPs預處理Raw264.7細胞1 h后，加入Ox-LDL共同作用泡沫細胞24 h后，收集細胞，確定蛋白濃度，然后將相同量的各蛋白樣品加入準備好的各電泳孔中進行10% SDS-PAGE電泳，然后將膠片轉膜至PVDF膜，用5%脫脂乳進行封閉，再用濾紙吸干封閉液，加入稀釋好的一抗(ACAT1抗體，nCEH抗體，SR-B1抗體)孵育過夜，然后與二抗孵育，結束后進行ECL顯色，并用Quantity-one軟件處理[15]。

1.3.4 細胞ACAT1和nCEH酶活性的檢測 不同濃度PPPs預處理Raw264.7細胞1 h后，加入Ox-LDL共同作用泡沫細胞24 h后，收集細胞，然后采用 ELISA試劑盒檢測ACAT1和nCEH的酶活力。

1.4 數據處理

所得數據采用均數±標準差表示，用 SPSS13.0軟件分析，差異顯著性檢驗采用單因素方差分析，并用 Duncan 法進行多重比較，P<0.05 為差異顯著，P<0.01差異極顯著，表示差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 Raw264.7巨噬細胞源性泡沫細胞模型的建立

由表2和圖1可知，總膽固醇、游離膽固醇和膽固醇酯含量均明顯增加，總膽固醇增加了近2倍，細胞內膽固醇酯占總膽固醇的比例(CE/TC)>50%，表示泡沫細胞模型建立成功[16]。油紅O染色結果顯示，巨噬細胞內無明顯紅色脂滴，而泡沫細胞內有大量紅色脂滴存在，進一步顯示泡沫細胞模型構建成功。

2.2 石榴皮多酚對HDL介導的巨噬細胞膽固醇流出的影響

圖2顯示，隨著PPPs濃度的增加，HDL介導的總膽固醇流出量也呈遞增趨勢，呈現一定的劑量效應關系，但5，25 μg/mL 劑量均未能達到差異顯著性，50 μg/mL劑量則極顯著增加了膽固醇流出量，增加量達50%以上。

2.3 石榴皮多酚對Raw264.7細胞SR-B1蛋白表達的影響

由圖3可知，Raw264.7細胞SR-B1蛋白的表達受到了PPPs影響，且當PPPs濃度為25 μg/mL時調控作用最顯著。利用Quantity-one軟件對SDS-PAGE圖譜進行量化，如圖4所示，當PPPs的劑量為25，50 μg/mL時，SR-B1蛋白的表達量顯著上調(P<0.01)，且以25 μg/mL劑量對SR-B1的上調作用最強。但PPPs對SR-B1蛋白表達的影響并未呈現良好的劑量關系。

表2 細胞泡沫化程度

圖1 巨噬細胞和泡沫細胞油紅O染色圖Figure 1 Macrophage and foam cell oil red O

**表示與對照相比差異極顯著(P<0.01)

圖3 不同濃度PPPs作用下SR-B1受體表達圖譜

Figure 3 The expression pattern of SR-B1 receptor after treatments with different concentrations of PPPs

**表示與對照相比差異極顯著(P<0.01)

Figure 4 Effect of PPPS on the protein expression of SR-B1 in Raw264.7 Macrophages (n=3)

2.4 石榴皮多酚對Raw264.7細胞ACAT1和nCEH蛋白表達的影響

由圖5可知，PPPs處理組對Raw264.7細胞ACAT1和nCEH蛋白的表達無顯著影響。利用Quantity-one軟件量化后的結果(圖6)，表明PPPs對Raw264.7細胞ACAT1和nCEH蛋白表達的作用不顯著(P>0.05)。

2.5 石榴皮多酚對Raw264.7細胞ACAT1和nCEH活性的影響

PPPs對Raw264.7細胞ACAT1和nCEH活性的影響見表3。在不同劑量PPPs受試物處理下，PPPs各劑量組顯著降低了ACAT1活性(P<0.01)，而顯著升高了nCEH活性(P<0.01)。說明PPPs可以減少膽固醇酯化，減少泡沫細胞內的脂滴。同時PPPs可以促進膽固醇酯水解，使膽固醇變為游離膽固醇，對促進膽固醇的流出具有積極意義。

圖5 不同濃度PPPs作用下ACAT1和nCEH

Figure 5 The proteins expression pattern of ACAT1 and nCEH after treatments with different concentrations of PPPs

圖6 石榴皮多酚對Raw264.7細胞ACAT1和nCEH

Figure 6 Effect of PPPs on ACAT1 and nCEH protein expression in Raw264.7 macrophages (n=3)

表3 石榴皮多酚對Raw264.7細胞ACAT1和nCEH活性的影響?

? **表示與對照相比差異極顯著(P<0.01)。

3 結論

本試驗研究了PPPs對HDL介導的膽固醇流出及相關蛋白SR-B1的調控作用，并揭示了PPPs對膽固醇在細胞內轉化的2個關鍵酶ACAT1和nCEH的影響。結果表明PPPs可以通過上調SR-B1蛋白促進膽固醇流出，同時，PPPs雖然未能顯著影響nCEH和ACAT1蛋白的表達，但是降低了ACAT1的活性，提高了nCEH的活性，有助于減少巨噬細胞內脂滴的蓄積，催化泡沫細胞脂滴中的膽固醇酯水解成游離膽固醇，并通過細胞膜上膽固醇運載體ABCA1、SR-B1將游離膽固醇轉運到外源性受體。本研究的結果完善了PPPs促進Raw264.7巨噬細胞膽固醇流出的機理，解釋了泡沫細胞被PPPs抑制的機制，為利用PPPs防治動脈粥樣硬化等心血管疾病提供了理論依據。

此外，本研究并未揭示PPPs對膽固醇流出關鍵酶ACAT1和nCEH酶活作用的機理，需要進一步深入探索PPPs對ACAT1、nCEH酶活影響的途徑，從而更加全面地解釋PPPs促進膽固醇流出的機制。