非小細(xì)胞肺癌并發(fā)糖尿病患者uPA異常表達(dá)的影響因素分析

孔冉冉 馬躍峰 馬震川 孫良章 張丹杰 李少民 姜建濤

非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)占全部肺癌的80%～85%，雖然我國(guó)肺癌切除率已提高至70%～97%，但患者術(shù)后5年生存率僅為27.2%～40.6%，其原因與多數(shù)患者明確診斷時(shí)病情已進(jìn)展至晚期有關(guān)[1]。與健康人群相比，NSCLC患者免疫功能顯著下降，而最新研究顯示，糖尿病與免疫反應(yīng)密切相關(guān)，糖尿病患者內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)失控所致糖代謝紊亂，可引發(fā)大量代謝產(chǎn)物堆積，進(jìn)而加劇機(jī)體免疫功能異常，形成惡性循環(huán)[2]。因此，了解影響NSCLC合并糖尿病患者預(yù)后的因素，對(duì)于指導(dǎo)臨床干預(yù)有著重要意義。尿激酶型纖溶酶原激活劑(urokinase plasminogen activator, uPA)是一種特異性絲氨酸蛋白水解酶，被認(rèn)為與腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移和腫瘤血管生成有關(guān)，且uPA的高表達(dá)可導(dǎo)致患者生存率下降[3]。本文就NSCLC并發(fā)糖尿病患者uPA異常表達(dá)的影響因素進(jìn)行了分析，旨在為患者預(yù)后的評(píng)估與預(yù)測(cè)提供參考依據(jù)。

資料與方法

一、一般資料

選取我院2016年3月至2019年3月收治的127例NSCLC并發(fā)糖尿病患者，以及同期39例NSCLC患者，分別納入研究組、對(duì)照組。選取標(biāo)準(zhǔn)：①于我院接受NSCLC外科手術(shù)治療，經(jīng)術(shù)后病理組織學(xué)檢查明確NSCLC診斷[4]；②癌組織及癌旁組織病理組織標(biāo)本保存完整，臨床資料保存完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤；②癌旁組織距癌組織距離不足5 cm；③術(shù)前行放療或化療。研究組男76例，女51例，年齡37～71歲，平均年齡57.91歲；對(duì)照組男25例，女14例，年齡35～68歲，平均年齡58.17歲。兩組患者性別、年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

二、研究方法

1. 檢測(cè)方法： 使用鏈霉素親生物素過(guò)氧化物酶連接法行免疫組化染色：取厚度4 μm癌組織、癌旁組織石蠟標(biāo)本，置于烤箱中，于60 ℃環(huán)境下使用二甲苯脫蠟，每次15 min，重復(fù)2次；使用無(wú)水乙醇洗除二甲苯，每次10 min，重復(fù)2次；依次使用95%、90%、80%、70%梯度酒精和蒸餾水洗滌標(biāo)本，各5 min；而后使用PBS溶液沖洗3次，每次5 min。標(biāo)本處理完畢后，使用新鮮配制的3%過(guò)氧化氫溶液室溫封閉30 min，滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。PBS緩沖液清洗3次后，采用石蠟切片微波爐抗原修復(fù)法完成抗原熱修復(fù)，PBS緩沖液清洗3次，使用正常羊血清工作液封閉，室溫孵育30 min。棄血清，滴加PBS緩沖液稀釋的第一抗體(uPA單克隆抗體1︰50稀釋)，50 μl/片，4 ℃孵育過(guò)夜。自冰箱內(nèi)將切片取出，恢復(fù)至室溫后，PBS溶液漂洗3次，每次5 min。而后依次滴加生物素標(biāo)記的第二抗體、辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液、新鮮配置的DAB溶液，室溫顯色。蘇木素復(fù)染、鹽酸酒精分化、自來(lái)水充分沖洗藍(lán)化后，使用梯度濃度酒精處理、二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固，顯微鏡下觀察結(jié)果。

2. 觀察指標(biāo)： 以胞漿內(nèi)存在棕黃色或棕褐色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞，根據(jù)染色強(qiáng)度、陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量，判斷uPA表達(dá)情況：染色強(qiáng)度：淺黃色、棕黃色、棕褐色分別計(jì)1分、2分、3分。陽(yáng)性細(xì)胞百分比：≤10%、11%～50%、51%～75%、>75%分別計(jì)1分、2分、3分、4分。總分=染色強(qiáng)度計(jì)分+陽(yáng)性細(xì)胞百分比計(jì)分。總分0～3分為陰性，總分>3分為陽(yáng)性[5]。

3. 影響因素： 對(duì)比研究組、對(duì)照組癌組織、癌旁組織uPA表達(dá)情況，并按照研究組癌組織uPA表達(dá)情況，將其分別納入陽(yáng)性組、陰性組，對(duì)比兩組患者年齡、性別、病理分型、組織學(xué)分級(jí)等臨床資料，運(yùn)用Logistic多因素回歸分析，總結(jié)影響NSCLC并發(fā)糖尿病患者uPA異常表達(dá)的相關(guān)因素。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

研究組癌組織uPA陽(yáng)性率為74.80%(95/127)，高于對(duì)照組的58.97%(23/39)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，兩組患者癌旁組織uPA表達(dá)均為陰性。陽(yáng)性組與陰性組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、TNM分期比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 陽(yáng)性組與陰性組臨床資料比較[n(%)]

Logistic多因素回歸分析示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期Ⅲ期+Ⅳ期均為影響NSCLC并發(fā)糖尿病患者uPA異常表達(dá)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 影響NSCLC并發(fā)糖尿病患者uPA異常表達(dá)的多因素回歸分析結(jié)果

討 論

合并糖尿病的惡性腫瘤患者機(jī)體免疫功能較差，術(shù)后易發(fā)生院內(nèi)感染，術(shù)后恢復(fù)緩慢；同時(shí)，有研究顯示，腫瘤及長(zhǎng)期高血糖所致機(jī)體免疫功能低下，與腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等不良預(yù)后也具有密切關(guān)聯(lián)[6-8]。最新研究顯示，uPA可激活纖溶酶原，使之成為有活性的纖溶酶，進(jìn)而導(dǎo)致大部分細(xì)胞外基質(zhì)蛋白降解[9-10]；此外，uPA還可激活基質(zhì)金屬蛋白酶，通過(guò)多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑，調(diào)控多種基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，進(jìn)而參與細(xì)胞增殖、遷移及血管生成等過(guò)程[11-13]。

有研究顯示，NSCLC合并糖尿病患者有著更高的病死率，而其病死率的上升與uPA異常表達(dá)有關(guān)[14-17]，與單純NSCLC患者相比，NSCLC合并糖尿病患者uPA陽(yáng)性率高達(dá)74.80%，印證了上述結(jié)論。因此，了解影響NSCLC合并糖尿病患者uPA異常表達(dá)的危險(xiǎn)因素，對(duì)于指導(dǎo)臨床預(yù)后評(píng)估與預(yù)測(cè)有著至關(guān)重要的意義。通過(guò)多因素分析，可以發(fā)現(xiàn)，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期Ⅲ期+Ⅳ期是導(dǎo)致患者uPA異常表達(dá)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，其機(jī)制可能為：①基質(zhì)降解是腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的重要前提，細(xì)胞外基質(zhì)的成分包括膠原、糖蛋白、蛋白多糖等，上述成分組成的結(jié)構(gòu)，是阻止正常細(xì)胞組織和大分子物質(zhì)穿過(guò)的有力屏障[18-20]。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生意味著基質(zhì)降解的加劇，同時(shí)，腫瘤細(xì)胞亦可促進(jìn)單鏈酶原結(jié)構(gòu)Pro-uPA的大量分泌，Pro-uPA與腫瘤細(xì)胞膜上特異性受體結(jié)合后，可激活生成雙鏈活性u(píng)PA，進(jìn)而降解細(xì)胞外基質(zhì)、基底膜，提高腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力，形成惡性循環(huán)[21-26]。因此，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移不僅是uPA異常表達(dá)的重要基礎(chǔ)，也是uPA異常表達(dá)的結(jié)果之一，故存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC合并糖尿病患者有著更高的uPA陽(yáng)性率與更差的預(yù)后結(jié)果；②uPA主要分布于腫瘤邊緣而非腫瘤中心，TNM分期Ⅲ期+Ⅳ期腫瘤往往具有膨脹性生長(zhǎng)的趨勢(shì)，故腫瘤細(xì)胞可分泌大量uPA以利于自身趨化、移行[27-28]。此外，惡性腫瘤患者凝血系統(tǒng)的異常與uPA表達(dá)升高有關(guān)，其原因與uPA激活纖溶酶原轉(zhuǎn)化為纖溶酶，進(jìn)而啟動(dòng)纖溶系統(tǒng)有關(guān)[29-30]，因此，隨著TNM分期的升高，患者凝血系統(tǒng)異常愈發(fā)嚴(yán)重，其uPA異常表達(dá)風(fēng)險(xiǎn)也有所上升。

綜上所述，NSCLC并發(fā)糖尿病患者癌組織uPA陽(yáng)性率明顯高于單純NSCLC患者，而導(dǎo)致患者uPA異常表達(dá)的因素包括淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期升高等，重視患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)與TNM分期的評(píng)估，有助于指導(dǎo)臨床預(yù)后的預(yù)測(cè)，從而指導(dǎo)治療決策與干預(yù)方案。