miR21介導Ang(1-7)對肺成纖維細胞AngⅡ誘導的NLR3炎性體激活的抑制作用

申光富 杜 培 余 蕊 謝召峰 羅長琴

肺纖維化是以成纖維細胞增殖及大量細胞外基質聚集并伴炎癥損傷、組織結構破壞為特征的一大類肺疾病的終末期改變，嚴重影響人體呼吸功能[1-2]。尤其是隨著特發性肺纖維化發病率和死亡率逐年增加，近年來受到科研工作者越來越多的關注，但是到目前為止其發病機制仍不清楚。研究表明，成纖維細胞是導致肺纖維化病程發生發展的主要細胞，因此研究成纖維細胞的增殖、凋亡及其可能的作用機制對肺纖維化的阻斷具有重要意義[3-4]。MiRNA作為一類小分子非編碼RNA，能夠與靶基因的非編碼區域結合，起到抑制甚至降解靶基因mRNA的作用。相關研究表明，miRNA的異常表達與多種疾病的發展密切相關[5-6]。miR21作為miRNA原癌基因的重要成員，在肺纖維細胞中過表達，且與肺成纖維細胞的增殖、遷移等密切相關，但是其具體作用機制仍不明了。血管緊張素參與了肺纖維化的發生、發展過程，AngⅡ、Ang1-7作為腎素-血管緊張素系統(RAS)重要的效應分子[7-9]，研究其在肺纖維化病程過程中發揮的作用具有十分重要的意義。鑒于此，本文探討了miR21在肺成纖維細胞中的表達及對肺成纖維細胞增殖、凋亡的影響，并進一步研究了miR21促進肺纖維化的可能機制。

材料與方法

一、實驗動物

健康1月齡SPF 級Wistar大鼠，體重50～80 g，雌雄各半，購自于北京維通利華有限責任公司，室溫、12 h︰12 h明暗交替喂養。

二、實驗方法

1. 大鼠原代肺成纖維細胞的分離、培養： 腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，在無菌環境下分離肺組織，剪碎處理后進行細胞培養：將PBS反復沖洗過的大鼠肺組織離心5 min，置于DMEM培養基中，培養基中添加15%胎牛血清、10 mmol/L的HEPES緩沖液及100 U/ml的青霉素和鏈霉素，于37 ℃、0.05 CO2、飽和濕度環境下的細胞培養箱中傳代培養，2～3 d更換1次培養液，約4～7 d后可見組織塊周圍有大量細胞生長。取對數生長期的細胞，用0.25%胰蛋白酶消化后離心棄去上清液，PBS清洗3遍。細胞傳代3次后收集細胞，以便后續檢測。

2. 大鼠原代肺成纖維細胞鑒定： 鑒定大鼠原代肺成纖維細胞采用甲苯胺藍染色和Ⅱ型膠原免疫熒光法。細胞爬片完成后，去除培養液，采取4%多聚甲醛將細胞固定30 min，采用PBS反復清洗3次，加入0.25%甲苯胺藍進行30 min染色，采用PBS反復漂洗3次，然后采4%多聚甲醛中進行15 min固定后，在室溫的條件下進行10 min的消化，采用PBS反復漂洗3次，在體積分數為5%的BSA 中進行45 min封閉，然后添加稀釋好的一抗( 1︰200 稀釋)，在4 ℃的條件下培養16 h。采用PBS沖洗細胞3次×5 min，添加稀釋好的熒光二抗(山羊抗兔熒光二抗)，室溫孵育1 h。隨后采用PBS反復清洗3次(避光)，加入DAPI后在顯微鏡下進行觀察并進行照相記錄。

3. 細胞轉染： 轉染前1 d，在不含青霉素及鏈霉素的DMEM培養基中接種細胞，細胞匯合度達50%時可進行轉染。采用riboFECTTMCP分別轉染NC、inhibitor(50 mmol)和mimic(50 mmol)：將各組細胞分別接種于6孔細胞培養板中，每孔約含1×104個細胞，培養1 d后，加入2微克相關質粒于400微升無血清DMEM培養基中，將PEI︰DNA=3︰1用200微升無血清高糖培養基稀釋，混勻后靜置5 min；然后兩者混合，震蕩15 s；隨后將轉染復合物滴加到相應孔中，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。6 h后置換培養基為胎牛血清完全培養基，胎牛血清濃度為10%。空白對照組不做轉染處理。

4. CCK8檢測miR21對肺成纖維細胞增殖的影響： 將處于對數生長期的大鼠肺成纖維細胞接種于96孔細胞培養板中，每孔約含1×104個細胞。分為空白對照組、miR21NC陰性對照組、miR21 inhibitor組、miR21 mimic組。培養24、48、72 h后，每孔加入20 μl(5 mg/ml)MTT液， 37 ℃孵育箱培養4 h，棄去培養液。每孔加入DMSO 150 μl，震蕩培養，采用酶標儀對其光密度OD值( 波長 570 nm)進行檢測。

5. 采用流式細胞儀檢測miR21對肺成纖維細胞凋亡的影響： 大鼠肺成纖維細胞接種于 24孔細胞培養板中，每孔約含1×104個細胞。分為空白對照組、miR21NC陰性對照組、miR21 inhibitor組、miR21 mimic組。培養24、48、72 h后，消化收集細胞。按照KGA107凱基細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行操作，采用 PBS對各孔進行清洗，將清洗的 PBS于離心管收集，然后以離心半徑8 cm，1 500 r/min離心5 min，去除上清，采用預冷的 PBS 進行重懸，舍去上清，反復操作2次，采取FITC結合液進行重懸，將重懸液移到1.5 ml 離心管中，在避光的條件下添加FITC，30 min 后添加 PI，孵育5 min后用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

6. RT-PCR法檢測miR21、Ang(1-7)、AngⅡ基因表達的變化： 各組肺成纖維細胞中分別加入Trizol試劑，常規方法提取RNA，采用逆轉錄反應體系擴增獲得產物cDNA，-20 ℃保存。采用聚合酶鏈式反應(RT-PCR)方法檢測miR21、Ang(1-7)、AngⅡ基因表達水平。PCR擴增條件為：95 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，70 ℃延伸25 s，循環40次，最后72 ℃延伸60 s。取10 μl擴增產物和6μl的DGL-200 Maker同時上樣，于2.5%的瓊脂糖凝膠電泳分離，紫外凝膠成像系統分析擴增結果并拍照。

7. 蛋白免疫印跡Western blot分析AngⅡ、NLRP3蛋白表達水平變化： 配置10%濃度的SDS-聚丙烯酰胺電泳凝膠，將凝膠置于電泳槽上，并將各組成纖維細胞提取蛋白上樣電泳。電泳后轉印到PVDF膜上，室溫封閉1 h。清洗后分別加入稀釋過(1︰1 000)的BAX、p53蛋白抗體，4 ℃過夜，TBST洗3次，每次5 min；隨后加入HRP標記的二抗(1︰500)，37 ℃作用2 h，TBST洗3次×5 min。設立陰性對照組，以GAPDH單克隆體為一抗，HRP標記的IgG為二抗。

三、統計學方法

結 果

一、大鼠原代肺成纖維細胞的培養及鑒定

顯微鏡下觀察分離培養的大鼠原代肺成纖維細胞呈梭形或星型，胞質透亮，核仁呈橢圓形，細胞鏈接緊密，邊緣光滑。對原代肺成纖維細胞進行PT-PCR檢測可知，成纖維細胞高表達其標志性波形蛋白(Vimentin)，而該蛋白在正常肺泡細胞中基本不表達，見表1。

二、miR21對肺成纖維細胞增殖的影響

CCK8檢測結果顯示，正常肺成纖維細胞在各時間點均能正常生長，增殖較為平緩。24 h時miR21各轉染組增殖情況與空白對照組進行比較，不具有明顯的差異(P>0.05)。在 48、72 h時間點，inhibitor、mimic組與NC對照組進行比較，inhibitor組OD值明顯降低，mimic組OD值顯著升高，差異具有統計學意義(P<0.05) 。NC組與空白對照組在各時間點OD450 值無明顯差異，不具有統計學意義(P>0.05)。即下調miR21表達后肺成纖維細胞增殖受到抑制，上調miR21表達后肺成纖維細胞增殖受到促進，說明miR21具有促進肺成纖維細胞增殖的作用，見表2。

表2 miR21對肺成纖維細胞增殖的影響

三、流式細胞儀分析細胞凋亡

采用流式細胞術檢測miR21對肺成纖維細胞凋亡的影響，結果表明，miR21 NC組在各時間段的細胞凋亡率分別為(28.20±5.27)%(24 h)、(35.23±4.32)%(48 h)、(38.34±5.57)%(72 h)，與空白對照組無明顯差異(P>0.05)。miR21過表達組肺成纖維細胞凋亡率在個時間段均較NC對照組顯著降低，miR21抑制組較NC組在各時間段細胞凋亡率均顯著提高，差異具有統計學意義(P<0.05)。即miR21具有顯著抑制肺成纖維細胞凋亡的作用，見表3。

表3 miR21對肺成纖維細胞凋亡的影響

四、miR21對肺成纖維細胞Ang(1-7)、AngⅡ基因表達的變化

表4 PCR過程中引物序列設計

miR21、Ang(1-7)、AngⅡ以及GAPDH引物設計，見表4。miR21、Ang(1-7)、AngⅡ在肺成纖維細胞中的表達，見表5及圖1。Real-time PCR基因檢測結果可知，與空白對照組相比，細胞轉染后，inhibitor組miR21表達水平降低，mimic組miR21表達水平升高，差異具有統計學意義(P<0.05)，證明細胞轉染成功。與miR21 NC組進行比較，miR21 inhibitor轉染后，上調了肺成纖維細胞Ang(1-7)表達，下調了AngⅡ表達；miR21 mimic轉染后，下調了Ang(1-7)表達，上調了AngⅡ表達，差異具有顯著性(P<0.05)，說明miR21具有抑制Ang(1-7)，促進AngⅡ表達的效果。

表5 RT-PCR 檢測miR21、Ang(1-7)、AngⅡ基因表達情況

圖1RT-PCR 檢測miR21、Ang(1-7)基因表達情況

五、miR21對肺成纖維細胞對AngⅡ、NLRP3蛋白表達水平變化

miR21對肺成纖維細胞對AngⅡ、NLRP3蛋白表達水平變化的影響見表6及圖2。蛋白免疫印跡檢測結果可知，與空白對照組相比，miR21 NC組在AngⅡ、NLRP3蛋白表達水平上無顯著差別(P>0.05)。inhibitor轉染miR21表達受到抑制后，均有下調AngⅡ、NLRP3水平的效果；mimic轉染miR過表達后，均有上調了AngⅡ、NLRP3水平的效果，差異具有統計學意義(P<0.05)。結果表明，miR21可通過上調AngⅡ、NLRP3水平促進肺成纖維細胞增殖并抑制其凋亡。

表6 miR21對肺成纖維細胞對AngⅡ、NLRP3蛋白表達水平的影響

圖2Western Blot 檢測AngⅡ、NLRP3蛋白表達情況

討 論

肺纖維化是一種嚴重的、慢性進行的以彌漫性肺泡壁增厚以及大量細胞外基質沉淀為特征的肺疾病，目前尚缺乏有效的治療措施，其具體的發病機制仍不明確[10-11]。成纖維細胞作為導致肺纖維化病程發生發展的主要細胞，廣泛分布于肺間質中，負責維持肺的正常形態并具有修復功能，其對細胞增殖、凋亡及對肺纖維化的預防及治療具有重要意義[12-14]。

miR21作為一個典型的miRNA原癌基因，在成纖維細胞中較正常肺泡細胞表達上調，可促進成纖維細胞的增殖并抑制細胞凋亡[15-17]；血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)可促進纖維化細胞因子的分泌，誘導炎癥體的激活[18-20]； Ang1-7可拮抗AngⅡ的促增殖及促纖維化的作用；NLRP3炎癥體的激活將會進一步導致肺纖維化的發生發展。但是miR21是否通過介導Ang(1-7)調節AngⅡ誘導PNLR3炎癥體激活，從而達到抑制或促進肺纖維細胞的增殖尚未見相關報道。

本文中我們以大鼠原代肺成纖維細胞為研究對象，CCK8檢測顯示，miR21 mimic轉染后，肺成纖維細胞增殖顯著增高，inhibitor轉染后，肺成纖維細胞增殖顯著降低，與NC組相比，差異具有統計學意義(P<0.05)，且隨著時間的延長，細胞的增殖促進或抑制作用更加明顯。流式細胞分析顯示，與NC組相比，轉染后miR21過表達組肺成纖維細胞凋亡率在各時間段均較對照組顯著降低顯著，miR21抑制組在各時間段細胞凋亡率均顯著提高，差異具有統計學意義(P<0.05)。由此提示，miR21具有顯著促進肺成纖維細胞增殖、抑制肺成纖維細胞凋亡的作用。RT-PCR基因檢測顯示，轉染miR21 mimic/inhibitor后，miR21的表達顯著提高/降低，說明質粒轉染成功。miR21 mimic/inhibitor轉染后，具有顯著下調/上調Ang(1-7)、上調/下調了AngⅡ表達的作用，說明miR21具有顯著抑制Ang(1-7)，促進AngⅡ表達的效果。蛋白免疫印跡Western Blot分析表明，miR21 mimic/inhibitor轉染后，上調/下調了AngⅡ、NLRP3蛋白表達水平，與NC對照組相比，差異具有統計學意義(P<0.05)。結果表明，miR21可介導Ang(1-7)顯著上調AngⅡ、NLRP3的表達，從而達到促進肺成纖維細胞增殖、抑制其凋亡的目的。

綜上所述，本研究表明miR21具有促進肺成纖維細胞增殖，抑制細胞凋亡的作用，其作用機制可能與miR21介導Ang(1-7)對肺成纖維細胞AngⅡ誘導的NLR3炎性體激活相關。但是其具體的作用機制尚不清楚，還需要進一步的深入研究。就目前研究結果表明，miR21可通過調控Ang(1-7)、AngⅡ、NLRP3表達在肺纖維化進展中發揮重要作用，這對于肺纖維化的診斷及治療具有十分重要的意義，同時也為肺纖維化的新的治療手段、抗纖維化藥物的研發提供了一定的實驗數據和理論支持。